近年來(lái)稻米的香味品質(zhì)受到消費(fèi)市場(chǎng)的格外重視。水稻OsBADH2基因是影響稻米香味的重要基因,選擇優(yōu)質(zhì)粳稻品種,針對(duì)該基因進(jìn)行基因編輯,有望創(chuàng)制出香味品質(zhì)優(yōu)異的粳稻材料。本研究通過(guò)分析OsBADH2基因外顯子序列的保守性,選擇了3個(gè)特異性靶點(diǎn),分別構(gòu)建了U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的包含不同靶點(diǎn)的gRNA表達(dá)盒,并將其連入植物基因編輯表達(dá)載體。利用基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,對(duì)非香型粳稻品種"吉粳88"進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,T₀代共獲得847株再生材料。經(jīng)高分辨率溶解曲線（High Resolution Melting,HRM）分析和測(cè)序驗(yàn)證,24株T₀代材料的OsBADH2基因編輯靶點(diǎn)發(fā)生了不同類型的編輯。在T₁代材料中獲得了7類不含轉(zhuǎn)基因成分,且OsBADH2基因靶點(diǎn)純合的基因編輯后代材料。本研究結(jié)果表明基于基因槍介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系,轉(zhuǎn)化再生過(guò)程中省略了抗性篩選過(guò)程,并輔以高效的HRM檢測(cè),能夠在T₁代即獲得位點(diǎn)發(fā)生純合編輯且無(wú)轉(zhuǎn)基因成分的基因編輯后代材料。本研究獲得的OsBADH2基因編輯的"吉粳88"后代材料也為培育... 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù)通報(bào). 2020,36(03)北大核心CSCD

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T1純合等位基因突變體比對(duì)分析

為快速檢測(cè)所獲得的后代材料是否在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)位置發(fā)生了編輯,本研究利用HRM檢測(cè)技術(shù)對(duì)T0和T1代材料進(jìn)行了分子鑒定。HRM檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示,后代材料的目標(biāo)片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線可清晰的區(qū)分突變體與野生型。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證,HRM檢測(cè)鑒定出的突變體,其靶點(diǎn)序列均發(fā)生了編輯。編輯類型主要為單堿基或多堿基缺失,以及部分堿基的替換。表2 培養(yǎng)基組分 培養(yǎng)基類型 培養(yǎng)基組分/(g·L-1) MS鹽 植物凝膠 蔗糖 2,4-D 6-BA NAA KT 山梨醇 甘露醇 NS 4.43 4 30 2×10-3 NS1 4.43 4 30 1×10-3 30 30 MD 4.43 4 30 8×10-3 5×10-4 4×10-3 MR 4.43 4 30 0.30 注:培養(yǎng)基pH值均為5.8

圖3 T1純合等位基因突變體比對(duì)分析在規(guī)�；幕蚓庉嬘N工作中,后代材料的分子檢測(cè)是重要的一環(huán)。盡管RFLP分析(Restric-tion fragment length polymorphism,RFLP)[15-16]、dC-APS衍生分析(derived cleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS)[17-18]、限制性酶切PCR法(Res-triction enzyme-PCR,RE-PCR)[19-20]以及測(cè)序分析能夠滿足編輯后代材料的鑒定需求[21]。然而,這些方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高,不適合規(guī)�；蚓庉嬘N工作。因此如何提高基因編輯后代材料的檢測(cè)效率、降低檢測(cè)成本,成為了優(yōu)化基因編輯育種體系的重要方面。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3100217