葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄需要兩種類似原核的RNA聚合酶,質(zhì)體編碼的RNA聚合酶（PEP）以及核基因編碼的RNA聚合酶（NEP）。PEP主要負(fù)責(zé)光合作用相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,而NEP更多的負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄看家基因。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)高溫敏感的白化突變體hsa1,圖位克隆結(jié)果顯示目的基因編碼果糖激酶類似蛋白FLN2,調(diào)控PEP轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá),進(jìn)而影響水稻葉綠體的發(fā)育。然而,水稻中的果糖激酶類似蛋白參與調(diào)控葉綠體合成的分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。經(jīng)過同源比對(duì),我們發(fā)現(xiàn)HSA1在水稻中有一個(gè)高度同源的蛋白FLN1。在此基礎(chǔ)上本研究主要以HSA1和FLN1為誘餌蛋白,對(duì)水稻幼苗cDNA酵母文庫進(jìn)行互作篩選,并通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證互作的真實(shí)性,進(jìn)而探索水稻葉綠體發(fā)育的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò),本文的研究結(jié)果如下:1.我們利用構(gòu)建好的水稻幼苗cDNA的酵母文庫,以O(shè)sFLN1BD和OsHSA1BD為誘餌載體對(duì)該文庫進(jìn)行篩選,共篩到與OsFLN1BD互作的陽性克隆32個(gè),與OsHSA1BD互作的陽性克隆60個(gè)。測(cè)序及讀碼框分析后OsFLN1BD共找到5個(gè)互作蛋白編碼基因,而Os HSA1BD共找到21個(gè)互作蛋白編碼基因,其中LO... 

【文章來源】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

體外與體內(nèi)的OsFLN1和HSA1與OsTRXz的互作驗(yàn)證(A)His-OsFLN1,His-HSA1和GST-OsTRXz的體外互作驗(yàn)證

圖 3.4：OsTRXz 葉綠體定位信號(hào)肽的確定關(guān)亞細(xì)胞定位結(jié)果。從上到下依次是：GFP 空對(duì)照；OsTRXz 的定位結(jié)果；將 OsT列去除后 OsTRXz 的定位結(jié)果；OsTRXz 蛋白中前 56 個(gè)氨基酸序列的定位結(jié)果。Figure 3.4: Chloroplast localization signal peptide of OsTRXz of subcellular localization of OsTRXz related. From top to bottom, the following are: Gof OsTRXz; the result of OsTRXz protein after removing the first 56 amino acid sequencino acid sequences in OsTRXz proteinTRXz 功能缺失會(huì)導(dǎo)致苗期白化并致死LN1 與 HSA1 參與葉綠體的生物合成。因此我們推測(cè)探究與 OsFLN1 可能也具有相似的功能，影響葉綠體的發(fā)育。利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)我定點(diǎn)突變。在 OsTRXz 基因組第二外顯子處，我們選擇了 GATTTCTACG敲除的靶序列，利用定點(diǎn)突變構(gòu)建引物 TRXz-F: ggcaGATTTCTACGCG aaacCACCACGTCGCGTAGAAATC 將該序列克隆至中間載體 pSK-gRN切 pSK-gRNA-TRXz 載體，回收 565bp 的目的片段，與 BamHI/Kas9 載體連接，測(cè)序正確后獲得 OsTRXz 定點(diǎn)突變載體 pTRXzcas9-2，

圖 3.5：CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 OsTRXz 定點(diǎn)缺失突變體(A) 對(duì) CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的 OsTRXz 定點(diǎn)缺失突變體進(jìn)行測(cè)序分析，標(biāo)藍(lán)字母為 Cas9/sgRNA 復(fù)合體靶序列，PAM 位點(diǎn)標(biāo)記為紅色。在 trxz 突變體中，對(duì)比原序列缺失的核苷酸用紅色連字符代替，插顯示為綠色。(B) trxz 定點(diǎn)突變體的苗期表型圖。Figure 3.5: Mutations of OsTRXz mediated by CRISPR/Cas9(A) Confirmation of clustered regularly interspersed short palindromic repeats (CRISPR) / single guide RN(Cas9/sgRNA)-mediated OsTRXz deletion in trxz plants. The 20-nt OsTRXz target sequence of the Cas9/sgRNis underlined in blue, and the pulse amplitude modulation (PAM) site is indicated in red. For the OsTRXz sequdetermined in trxz plants, deleted nucleotides are depicted as red dots, whereas substituted and inserted nucleoshown in green. (B) Phenotype of trxz seedlings.3.6 trxz 突變體表型分析針對(duì) trxz 的白化表型，我們對(duì) trxz 突變體中葉綠素含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，與比，trxz 中葉綠素含量顯著降低（圖 3.6A）。為了確定 trxz 突變體中 OsTRXz 功能缺失發(fā)育的影響，我們將三葉期 trxz 突變體中的葉綠體提取后進(jìn)行掃描電鏡觀察，同時(shí)也將葉綠體結(jié)構(gòu)作為對(duì)照。結(jié)果顯示，野生型葉綠體結(jié)構(gòu)正常，基粒片層密集排列；然而在

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號(hào)：3049215