龍牙楤木和三七都是五加科重要藥用植物,龍牙楤木中香樹(shù)素合酶基因0β-AS)及三七鯊烯合酶基因（PnSS）都是三萜皂苷類(lèi)物質(zhì)合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因。本文將龍牙楤木β-AS基因與三七PSS基因分別轉(zhuǎn)入煙草與龍牙楤木中,利用qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草及龍牙楤木中4種關(guān)鍵酶基因（FPS、SS、SE、β-AS）和龍牙楤木中PnS基因的相對(duì)表達(dá)量,利用高效液相分析方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因龍牙楤木愈傷與體胚中角鯊烯和齊墩果酸的含量,并探究了 MeJA處理對(duì)轉(zhuǎn)基因楤木體胚皂苷合成4種關(guān)鍵酶基因相對(duì)表達(dá)量與角鯊烯和齊墩果酸含量的影響。具體結(jié)果如下:1.構(gòu)建龍牙楤木β-AS基因植物表達(dá)載體,獲得12個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系,檢測(cè)4種關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草4種酶基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于野生型,其中株系16、17相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它株系;株系16的FPS、SS基因的相對(duì)表達(dá)量最高;株系17的SE、β-AS基因的相對(duì)表達(dá)量最高。2.將三七SS基因轉(zhuǎn)入龍牙楤木中,得到6個(gè)轉(zhuǎn)基因龍牙楤木胚性愈傷組織系與6個(gè)體胚苗系,檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因株系中4種關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因愈傷組織系中,下列無(wú)性系中關(guān)鍵酶基因的... 

【文章來(lái)源】：東北林業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：57 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１?（３－ＡＳ基因擴(kuò)增結(jié)果??

??圖２－２表達(dá)載體的ＰＣＲ鑒定??注：圖中數(shù)字為挑取的單菌落??２．３．２龍牙锪木基因轉(zhuǎn)化煙草及檢測(cè)??２．３．２．１?ＰｒｏｋＩＩ－＾４５表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌??用Ｐｒｏｋｌｌ－＾－ｊＳ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，２８°Ｃ恒溫培養(yǎng)２天，隨機(jī)挑取單克隆，以／ＶｏＨＺ－??Ｆ和盡？?jī)海樱�？為引物進(jìn)行菌液ＰＣＲ，１％凝膠電泳結(jié)果顯示，有單菌落擴(kuò)增出大約２?２００??ｂｐ左右的擴(kuò)增片段，與目標(biāo)片段的大小相似，如圖２－３所示，ＰｒｏｋＩＩ－界乂Ｓ質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)??入農(nóng)桿菌中，可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。??Ｍａｒｔｔａ？?＾?２３名?Ｓ?６?７?８??Ｓ３０００Ｐ?＾?＂＊?Ｘ?＾?ｒ％?＼?，??ｎ．。?．ｆ．＂１??２０００＆ｅ?ｋ：．＇??１５００ｂｐ——??ｉｏｏ〇ｂｐ?ｊ??７５Ｓ３〇??５０Ｑ〇ｐ?＿?：ｊ??２００ｂ〇???＾０％ｐ?Ｖ＇ｊ??圖２－３農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化ＰＣＲ驗(yàn)證??注：圖中數(shù)字為挑取的單菌落??２．３．２．２轉(zhuǎn)基因煙草植物再生??剪切煙草葉子，放入培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)三天，利用農(nóng)桿菌菌液侵染煙草葉片，共培養(yǎng)??２?ｄ后（如圖２－４?Ａ），將其放在選擇培養(yǎng)基中光培養(yǎng)，農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)受到頭孢霉素、特美??汀的抑制

??圖２－４轉(zhuǎn)基因煙草再生??注：Ａ：共培養(yǎng)煙草；Ｂ：轉(zhuǎn)化培養(yǎng)２０天；Ｃ：非轉(zhuǎn)基因煙草；Ｄ：轉(zhuǎn)基因煙草??２．３．２．３轉(zhuǎn)基因煙草檢測(cè)??經(jīng)過(guò)篩選，獲得３０個(gè)煙草系。利用ＰＣＲ技術(shù)初步篩選了?１２個(gè)陽(yáng)性愈傷組織系（株??系?７，１４，１５，１６，１７，?２０，２１，２２，２３，?２４，２６，２８）凝膠電泳結(jié)果如圖?２－５?所示。??Ｍａｆｔｅｆ?１?ＩＳ?ｉ７?１８?２０?２１?２ｇ?Ｓ５?Ｓ?ＳＳ?２７?２３?ｇ？?２?３?木??＇．ＯＤＤｂｐ?；＇Ｖ＇?＾??Ｍａｒｋｅｒ?４?５?７?８?１０?１１?１２?１３?１４?１５?２９?幻?水??ＪＢＢＢｉ??圖２－５再生植株ＰＣＲ檢測(cè)??注：圖中數(shù)字為不同株系煙草??２．３．３轉(zhuǎn)基因煙草中關(guān)鍵酶基因表達(dá)分析??利用ｑＲＴ－ＰＣＲ的方法檢測(cè)了野生型與轉(zhuǎn)基因煙草仲又涊、見(jiàn)、斤必基因相對(duì)表??達(dá)量，結(jié)果如圖２－６所示：轉(zhuǎn)基因煙草即義怒、見(jiàn)、／？－必基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于??野生型，其中株系１６、１７相對(duì)表達(dá)量顯著高于其它株系及對(duì)照，株系１６的沖又怒基??因的相對(duì)表達(dá)量最高；株系１７的Ｓ￡、基因的相對(duì)表達(dá)量最高。??ｉｌＬｉＷｉ?幽丄二??ＷＴ?７?１６?１７?２Ｘ?２＊?２６??煙草株系?ＷＴ?７?１６?１７?ＺＬ?２４?２６??煙草株系??１〇〇?廠?ａ??６０「

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]靈芝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中高表達(dá)靈芝鯊烯合酶基因提高靈芝酸單體的生產(chǎn)[D]. 任夢(mèng)飛.昆明理工大學(xué) 2015
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[3]靈芝異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶基因的克隆及其表達(dá)特性的研究[D]. 姚健.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011
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[5]龍牙楤木總皂甙對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷sVCAM-1表達(dá)及MDA、SOD影響的研究[D]. 王婷.北京中醫(yī)藥大學(xué) 2009



本文編號(hào)：3019071