氮是植物體內(nèi)蛋白質、磷脂、核酸、激素、維生素,以及一些輔酶、輔基等物質的主要組分,對植物的生長發(fā)育進程有重要作用。它還是植物葉綠素的重要組成元素,可以影響植物的光合速率。不僅如此,氮營養(yǎng)水平可以改變植物體內(nèi)的氮-碳平衡,對作物最終產(chǎn)量的貢獻約為45%。而且,低氮條件還可以影響生長素合成基因(TAR2)、植物激素運輸相關基因的表達水平,這將改變生長素等在根中的積累量,從而促進植物側根的發(fā)育,增加植物對氮營養(yǎng)的吸收效率。棉花是一種對氮肥敏感的植物,其產(chǎn)量的提高主要靠施用大量的氮肥。然而,棉花對氮肥的利用率低,尤其是我國。大量施氮不僅不能被植物吸收,還會造成土壤板結,進一步降低氮肥的吸收效率,從而使水土富營養(yǎng)化,影響生態(tài)平衡。因此,“少施肥,高產(chǎn)棉”就成為棉花栽培與育種生理學的研究熱點。γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳的非蛋白質氨基酸,對植物多種逆境脅迫,如酸堿脅迫、低溫、熱刺激、高鹽、機械損傷等均產(chǎn)生響應;其本身亦可作為氮源發(fā)揮作用,通過GABA支路調節(jié)氮-碳平衡。本論文從外源添加和內(nèi)源途徑改變植物體內(nèi)GABA含量,探究GABA在棉花低氮脅迫中的作用,主要研究結果如下:1、低氮脅迫對棉花GABA水平的影響低氮處理海島棉8 d,檢測根系GABA含量,發(fā)現(xiàn)‘XH12’品種GABA含量由正常處理組的4.21μg/g(FW)顯著上升到5.43μg/g(FW);‘XH21’品種同樣由正常處理組的4.67μg/g(FW)顯著上升到5.60μg/g(FW);并且,冀棉14在遭受低氮脅迫14 d后,相較于正常供氮水平,其根中GABA含量由2.47μg/g(FW)增加到6.11μg/g(FW);低氮處理29 d后,GABA含量由2.87μg/g(FW)增加到4.47μg/g(FW)。再者,對T_4代GhPOP2(pollen pistil interaction)轉基因棉花低氮處理14 d,檢測GABA含量發(fā)現(xiàn),無論上調還是下調GhPOP2轉錄水平,GABA含量在低氮條件下均顯著升高。以上結果表明,棉花在遭受低氮脅迫時,會誘導內(nèi)源GABA含量顯著上升,這可能為棉花提供更多的氮源物質,從而提高其對低氮脅迫的耐受力。2、低氮脅迫棉花的轉錄組分析對不同氮營養(yǎng)利用效率的海島棉和陸地棉進行低氮處理,轉錄組測序結果顯示,在新陸早和新海棉花品種中分別發(fā)現(xiàn)3598、1801個基因轉錄水平有顯著差異;低氮處理下,氮低效品種相比于氮高效品種,顯著差異的基因有433個,當中有271個基因顯著上調,162個基因顯著下調;標氮處理下,氮低效品種相比于氮高效品種,顯著差異的基因有15個,當中8個基因顯著上調,7個基因顯著下調。進一步對低氮處理的海島棉和陸地棉進行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),這些差異基因主要富集在谷氨酸代謝、激素信號轉導,以及類胡蘿卜素生物合成等途徑。GABA與谷氨酸代謝密切相關,而GhPOP2基因編碼的GABA-T是GABA降解代謝的首要限速酶。檢索轉錄組中GhPOP2基因的轉錄水平,發(fā)現(xiàn)低氮脅迫下,陸地棉和海島棉根中GhPOP2基因的表達水平升高;而GAD的表達水平在陸地棉中上調,海島棉中卻下調。這可能是海島棉和陸地棉品種在低氮脅迫下對谷氨酸的需求存在差異所致。3、低氮脅迫對棉花中GhPOP2轉錄水平的影響GhPOP2基因啟動子在棉花的各部位均有表達,但它主要在花瓣、雄蕊、柱頭、胚珠等生殖器官中表達。研究發(fā)現(xiàn),野生型棉花低氮處理后,根和子葉GhPOP2表達量相比于對照組顯著升高;對冀棉14進行不同時間的低氮處理,通過RT-PCR檢測GhPOP2表達量,發(fā)現(xiàn)其在根系表達水平首先升高,然后信號依次向下胚軸、子葉傳導;另外,對轉入P_(GhPOP2)::GUS的轉基因棉花進行低氮處理,組織化學染色顯示,低氮處理7 d的植株,相比于未處理對照組GUS信號明顯加強,且其葉片的保衛(wèi)細胞也出現(xiàn)了GUS信號,這暗示GABA代謝過程參與了植物對低氮脅迫的響應;同時轉入P_(GhPOP2)::GUS轉基因擬南芥低氮處理后,GUS信號也在其根尖增強。這些結果初步表明,低氮脅迫可以誘導GhPOP2基因的表達,這種誘導作用在根中更明顯。為了更好地了解GhPOP2基因的功能,構建了pLGN-35S-GhPOP2::GFP表達載體,在煙草葉片中進行瞬時表達,與線粒體marker共定位后發(fā)現(xiàn),GhPOP2基因定位在線粒體上。4、超量表達GhPOP2基因增加棉花植株對低氮脅迫的耐受性為通過分子手段調控棉花內(nèi)源GABA含量,構建了GhPOP2的超量、反義、干擾植物表達載體,對棉花進行遺傳轉化,篩選得到相應的轉基因植株。檢測轉基因植株中GABA含量發(fā)現(xiàn),超表達GhPOP2使GABA含量降低,反義和干擾植株GABA含量則升高。對低氮處理的GhPOP2轉基因植株的表型觀察發(fā)現(xiàn),超量植株對氮脅迫的耐受力要明顯高于野生型和反義植株,在野生型和反義植株葉片均明顯發(fā)黃、脫落的情況下,超表達植株仍是正常的葉片表型。其原因可能是超表達GhPOP2加大了GABA的降解水平,從而為植物提供所需的氮源。這使植株葉綠素含量升高,并促進了其光合速率的增強;而下調GhPOP2的表達量則是相反的結果。
【學位單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S562
【部分圖文】：

西南大學碩士學位論文透強度、信號傳導(Fait et al., 2008)、調控植物的生長發(fā)育進程(Akihiro et al., 2008)，以及調控擬南芥的受精作用(Renault et al., 2011)等。由此可見，GABA 對動物、植物和微生物都是一種重要的生理活性物質，對它的深入研究是極有必要的。1.2.2 植物體內(nèi) GABA 的合成代謝在細菌和哺乳動物中的研究發(fā)現(xiàn)，細胞質中的 GABA 是由谷氨酸在谷氨酸脫羧酶（glutamate decarboxylase, GAD）的催化下生成，再在 GABA 轉氨酶（γ-Aminobutyrate transaminase, GABA-T）的催化下，與 α–酮戊二酸發(fā)生轉氨基作用生成谷氨酸（Glu）和琥珀酸半醛（SSA）；琥珀酸半醛又在琥珀酸半醛脫氫酶（succinate semialehyde dehydrogenase, SSADH）的催化下被氧化，生成琥珀酸進入三羧酸循環(huán)（tricarboxylic-acid, TCA），為 TCA 循環(huán)提供所需的碳源。以上的從 α-酮戊二酸生成谷氨酸又脫羧生成 GABA,直到 GABA 降解，最終生成琥珀酸這一途徑被稱為 GABA 支路（圖 1.1）(Barry et al., 1997)。

圖 4.1 不同氮效棉花品種中基因表達量差異火山圖和維恩圖Figure 4.1 Difference in gene expression of cotton with different nitrogen efficiency Volcanoplots and Venn diagramsHE:High-NUE cultivar(NUE: Nitrogen use efficiency),氮高效利用；LE: Low-NUE cultivar,氮低效利用；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-, LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; （A）低氮處理下差異基因火山圖：橫坐標為處理樣的表達量/對照樣的表達量，縱坐標為基因表達量變化差異的統(tǒng)計學檢驗值，該值越高表明表達差異越顯著；（B）標氮處理下差異基因火山圖；（C）每個大圈中數(shù)字之和表示該組差異基因總個數(shù)，圓圈交叉部分表示兩組間共有的表達基因，以 fpkm>2 為基因表達的標準。(A) Differential gene volcano plots under low nitrogen treatment: the abscissa is the expression level of thetreated sample/the expression level of the control, and the ordinate is the statistical test value of the difference inthe expression level of the gene. The higher the value is, the more significant the expression difference is. (B)Differential gene volcano map under standard nitrogen treatment. (C) The sum of the numbers in each large circleindicates the total number of differential genes in the group, and the circled cross indicates the genes commonlyexpressed between the two groups. The fpkm>2 is the standard for gene expression.

29圖 4.2 低氮處理下基因表達量差異散點圖和維恩圖Figure 4.2 The Scatter and Venn diagram of gene expression differences under low nitrogentreatmentGh: Gossypium hirsutum 陸地棉；Gb:Gossypium barbadense 海島棉；NN(Normal Nitrogen)=5 mmol/L NO3-,LN(Low Nitrogen)=0.1 mmol/L NO3-; Dn：down 下調；Up: 上調；（A）低氮脅迫下陸地棉基因表達量差異散點圖：橫坐標值為該基因在對照樣中的表達量，每個點代表一個特定的基因，縱坐標值為該基因在處理樣中的表達量；（B）低氮脅迫下海島棉基因表達量差異散點圖；（C）低氮下，陸地棉、海島棉顯著性差異基因分別上調、下調的維恩圖。(A) The Scatter diagram of gene expression differences under low nitrogen treatment in Gh: The abscissa value isthe amount of expression of the gene in the control. Each point represents a specific gene. The ordinate value is theexpression level of the gene in the treated sample. (B) The Scatter diagram of gene expression differences underlow nitrogen stress treatment in Gb. (C) The Venn diagram of gene expression differences under low nitrogenstress treatment in Gh and Gb.
【參考文獻】

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本文編號：2883958