發(fā)布時間：2020-11-02 01:19

　　 豬苓[Polyporus umbellatus(Pers.)Fr.]是一種藥用真菌,具有利尿去水腫的作用;它的生長經(jīng)歷有三個階段:菌核、菌絲、子實體,其中菌核為藥用部分,本論文通過研究豬苓菌核的表達序列標簽(EST),為深入研究豬苓菌核的形成機制,分析物種在基因組學上的差異提供理論依據(jù)。以采自陜西省佛坪縣的三年生豬苓菌核為原材料,通過EASY spin植物快速提取試劑盒提取總RNA,經(jīng)電泳檢測條帶清晰,OD260/280在2.0-2.1之間,產(chǎn)量符合反轉(zhuǎn)錄的要求;利用SMART法成功構(gòu)建了豬苓菌核的cDNA文庫,原始文庫滴度為6.55×106pfu/ml,重組率為94.26%,插入片段長度均大于100bp,擴增文庫滴度為1.821×1010pfu/ml,符合一個質(zhì)量較好的文庫標準。隨機選取500個單克隆進行單方向測序,獲得高質(zhì)量序列共371條,平均長度為383bp;經(jīng)聚類拼接后得到包含127條ESTs的共46個重疊群和244個單拷貝序列,形成了共290條單基因簇,文庫的冗余度為21.83%;參照植物基因功能目錄對照與nr數(shù)據(jù)庫已知功能序列相似性高的序列推測其蛋白質(zhì)具有的功能共分為11類,分別為蛋白質(zhì)合成、疾病/防御、代謝、信號轉(zhuǎn)導、能量、轉(zhuǎn)運、細胞生長/分裂、轉(zhuǎn)錄、細胞結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)途徑及次生代謝。僅有160條序列獲得一條或一條以上GO功能基因注釋;其中被注釋為細胞組分(Cellular component)的包括9種功能;被注釋為生物學過程(Biological process)的包括15種功能;被注釋為分子功能(Molecular function)的包括3種功能。將所得序列提交到KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對,共有116個基因獲得了 Knumber,其中有98個基因被帶入到通路中,涉及到的通路共153條;其中基因參與最多的通路為代謝(metabolic pathway),共有22個基因參加;根據(jù)與nr數(shù)據(jù)庫中已知蛋白質(zhì)序列高同源性為原則,選取10條與nt/nr數(shù)據(jù)庫內(nèi)已登陸基因高同源性序列,并對其高同源性基因及其編碼蛋白進行分析,預(yù)測未知基因及蛋白質(zhì)的功能與結(jié)構(gòu)。
【學位單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S567.3
【部分圖文】：

圖１中國豬苓資源分布地圖??Ｆｉｇｌ?．Ｔｈｅ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｉｎ?Ｃｈｉｎａ??３有關(guān)豬苓在分子生物學領(lǐng)域的研究概況??近年來有關(guān)豬苓的遺傳多樣性、種群差異結(jié)構(gòu)、功能基因克隆分析等多物學研宄正在逐步開展。??劉開輝等［５－７］對三種不同形態(tài)豬苓菌核的ｒＤＮＡ?（１８ｓ?ｒＤＮＡ和ＩＴＳ１－５－ＩＴＳ２）和ｐ－ｔｕｂｌ進行擴增測序比對，結(jié)果表明三種形態(tài)的豬苓菌核的ｒＤ

圖２兩種方法提取豬苓菌核總ＲＮＡ??Ｆｉｇ２?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡｓ?ｆｒｏｍ?ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ?ｏｆ?Ｐ．?ｕｍｂｅｌｌａｔｕｓ?ｕｓｉｎｇ?ｔｗｏ?ｍｅｔｈｏｄｓ??如圖２所示，試劑盒法所提取的總ＲＮＡ，２８ｓ與１８ｓ十分清晰，亮度比約為??２：１，且５ｓ處的條帶比較清晰，說明ＲＮＡ的完整性比較好，未發(fā)生降解；而Ｔｒｉｚｏｌ??改良法所提取的總ＲＮＡ，?５ｓ處的條帶要明顯亮于２８ｓ與１８ｓ，且出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，??說明ＲＮＡ的完整性很差，己經(jīng)發(fā)生了降解。??表１不同方法提取豬苓菌核純度與產(chǎn)置比較??Ｔａｂｌｅ?１?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｑｕａｌｉｔｙ?ａｎｄ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?ｅｘｔｒａｃｔｅｄ?ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｂｙ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｍｅｔｈｏｄ??方法?樣品編號?＾?產(chǎn)量（Ｈｇ／ｇ）???Ｍｅｔｈｏｄｓ?Ｓａｍｐｌｅｓ?‘⑷？８０?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ??試劑盒法?１?２．０６?２．４６??ＥＡＳＹ?Ｓｐｉｎ?Ｐｌａｎｔ?ＲＮＡ?ｋｉｔ?２?２?０９?３?３１??ｍｅｔｈｏｄ??Ｔｒｉｚｏｌ?改良法?３?２．２４?６．４３??Ｉｍｐｒｏｖｅｄ?Ｔｒｉｚｏｌ?ｍｅｔｈｏｄ?４?２．２６?６．９４??純的ＲＮＡ樣品ＯＤ２６Ｇ／２８０應(yīng)在１．７－２．２之間，若ＲＮＡ樣品的ＯＤ２６〇／２８〇比值太??小，表明有蛋白質(zhì)或酚污染？，當ＯＤ２６０／２８０大于２．２時，說明ＲＮＡ己經(jīng)水解成單核??酸了如表中所示，采用試劑盒法所提取的ＲＮＡ樣品ＯＤ值均在２．０－２．１之間，??說明ＲＮＡ純度較好；采用Ｔｒｉｚｏｌ改良法所提取的ＲＮＡ樣品ＯＤ值均大于２．２

ＬＤ－ＰＣＲ所得到的ｄｓ－ｃＤＮＡ經(jīng)蛋白酶Ｋ消化，Ｓｆｉ?Ｉ酶切及ＣＨＲＯＭＡ??ＳＰＩＮ－４００分級分離后，得到１６管修飾后的產(chǎn)物，１％瓊脂糖凝膠電泳檢測得到如??圖４所示：??■物．．丨．．．．???｜????：?—??ＢＨＨ??１－１６?修飾后的?ｄｓ－ｃＤＮＡ，Ｍｌ?ＤＬ１５０００?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｍ２?ＤＬ?２０００?Ｍａｒｋｅｒ??圖４?ｃＤＮＡ分級分離??Ｆｉｇ?４?Ｔｈｅ?Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃＤＮＡ??如圖４所示，第９－１２管的ｃＤＮＡ片段長度均大于７５０ｂｐ，合并這四管的產(chǎn)物??并進行純化。??３．４原始文庫滴度與重組率檢測??原始文庫經(jīng)稀釋１００倍后進行倒板培養(yǎng)，分別進行滴度的測定及藍白斑篩選??（表?２）：??７??
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2866371