油菜種子的含油率是油菜的重要農(nóng)藝性狀之一,提高油菜的含油率可以增加油菜產(chǎn)油量,提高油菜種植效益。植物中脂肪酸的生物合成是一個非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不僅受到植物體內(nèi)多種酶、底物、能量和轉(zhuǎn)錄因子等的調(diào)控,還受到外界環(huán)境因素如光、溫度、氧氣濃度等的影響。三磷酸核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTT)可以將胞質(zhì)ATP轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)體中,滿足脂肪酸合成和其他代謝活動需要,而植物NTT是否通過輸送ATP參與調(diào)控種子油脂合成還尚未見報道。本研究基于脂肪酸代謝通路,從能量代謝與脂質(zhì)生物合成的關(guān)系入手,利用分子生物學(xué)方法,探究甘藍(lán)型油菜BnNTT基因參與調(diào)控脂肪酸生物合成的機(jī)制。首先,本研究運(yùn)用生物工程技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)和CRISPR/Cas9基因編輯體系載體。然后,以甘藍(lán)型油菜Westar材料為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因植株。再借助GC-MS分析轉(zhuǎn)基因植株成熟種子的含油率和脂肪酸組成。最后結(jié)合種子脂質(zhì)合成過程中的基因表達(dá)量數(shù)據(jù),從而綜合性分析BnNTT基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜種子中油脂積累調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)基因植株中利用CaMV 35S啟動子驅(qū)動BnNTTA7-1基因過量表達(dá),植株成熟種子的油脂含量顯著性降低,暗示BnNTTA7-1對甘藍(lán)型油菜種子中的脂肪酸合成具有一定的抑制作用。另外,由CaMV 35S啟動子分別驅(qū)動BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8基因在轉(zhuǎn)基因植株中超表達(dá),結(jié)果顯示成熟種子的含油率均有顯著性升高,因此我們推測BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8在一定程度上正向調(diào)控甘藍(lán)型油菜種子油脂的積累。此外,通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得的BnNTTA7-1、BnNTTC6-1和BnNTTC6-2三個基因均被編輯的轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)突變體A7C6~(Mutant)植株的含油率與野生型相比沒有顯著的差異。研究結(jié)果還顯示,CRISPR突變體材料的脂肪酸組成與35S過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株材料的脂肪酸組成相比存在顯著的差異,表明BnNTTA7-1、BnNTTC6-1、BnNTTC6-2和BnNTTC8 4個基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜油脂合成的調(diào)控機(jī)制不盡一致。本研究通過探究NTT轉(zhuǎn)運(yùn)體在油菜種子油脂積累過程中的調(diào)控作用,填補(bǔ)了脂質(zhì)合成代謝中NTT轉(zhuǎn)運(yùn)體分子機(jī)制的空白,為油菜高油育種提供理論基礎(chǔ),同時也為植物油脂合成研究提供新思路。
【學(xué)位單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.4
【部分圖文】：

ACCase 和 FAS 是參與反應(yīng)的關(guān)鍵酶（圖1）。ACCase 是一類生物素酶，以乙酰 CoA 為底物，利用 ATP 對生物素進(jìn)行羧基化，將羧基轉(zhuǎn)移到乙酰 CoA 上形成丙二酰 CoA（malonyl-CoA），完成脂肪酸合成的第一步。然后，�；D(zhuǎn)移酶（acetyl transferase, AT）催化丙二酰 CoA，使丙二�；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移至�；d體蛋白（acyl carrier protein,ACP）上，生成丙二酰-ACP(胡軍 2013,郭磊 2015)。脂肪酸合酶復(fù)合體（fatty acid synthase, FAS）是由多種酶組成的復(fù)合物，該復(fù)合物介導(dǎo)酰基轉(zhuǎn)移、碳鏈延伸和反應(yīng)的終止。β-酮酯酰酰基載體蛋白酶（β-ketoacyl-ACP synthases, KASs）是 FAS 的重要組成成分之一

ATP產(chǎn)生的基本機(jī)制已經(jīng)得到了廣泛研究，但是對于介導(dǎo)ATP轉(zhuǎn)運(yùn)的載體蛋白的生理功能認(rèn)識有限。NTT是一類可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)與質(zhì)體間ATP/ADP交換的質(zhì)體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（圖2），用以維持質(zhì)體內(nèi)腺苷酸化學(xué)計量數(shù)的均衡(Heldt 1969, Schunemann and Borchert et al1993)。目前在所有的高等植物和藻類中均發(fā)現(xiàn)NTT的存在(Reinhold and Alawady etal 2007, Tyra and Linka et al 2007)。并且，根據(jù)遺傳進(jìn)化樹分析表明，植物NTT很有可能是從衣原體分裂前水平轉(zhuǎn)移到植物核基因組上的(Wolf and Aravind et al 1999,Schmitz-Esser and Linka et al 2004, Moustafa and Reyes-Prieto et al 2008) 。圖2 葉綠體與胞質(zhì)內(nèi)主要代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)示意圖(Weber and Linka 2011)Fig.2 Overview of the metabolite transport processes between chloroplasts and cytosol involvedin the major plastidial pathways(Weber and Linka 2011)1.2.4.1 NTT 轉(zhuǎn)運(yùn)體在原核生物中的研究生物體中，大量的合成代謝需要ATP提供能量，如氨基酸的合成、脂肪酸的生物合成等。研究發(fā)現(xiàn)，原核生物立克次體和衣原體含有多個具有不同功能的NTT轉(zhuǎn)運(yùn)體，它們既可以作為ATP/ADP雙向運(yùn)輸?shù)妮d體，又可以實(shí)現(xiàn)ATP和ADP的單向轉(zhuǎn)運(yùn)

2.2 技術(shù)路線本研究基于已知的脂肪酸代謝通路，聚焦于能量代謝與脂質(zhì)生物合成的關(guān)系，利用分子生物學(xué)方法，探究質(zhì)體中甘藍(lán)型油菜 BnNTT 基因參與脂肪酸生物合成的調(diào)控機(jī)制。首先，本研究運(yùn)用生物工程技術(shù)構(gòu)建過表達(dá)和 CRISPR/Cas9 基因編輯體系載體；然后，以甘藍(lán)型油菜 Westar 材料為受體對載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得轉(zhuǎn)基因植株；再從 DNA、RNA 和蛋白等分子水平檢測轉(zhuǎn)基因植株確定陽性株系，并通過轉(zhuǎn)基因植株種子中的酶活水平、質(zhì)體內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中 ATP 含量以及種子含油率、脂肪酸組成等代謝水平與植株千粒重和株型等的農(nóng)藝性狀表型數(shù)據(jù)相結(jié)合，從而綜合性分析BnNTT 基因?qū)Ω仕{(lán)型油菜種子中油脂積累調(diào)控作用。最后，利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測 NTT 蛋白在植株中的表達(dá)部位，進(jìn)而解析 NTT 轉(zhuǎn)運(yùn)體在脂肪酸合成代謝中的分子機(jī)制。
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