纖維素是黃麻纖維的主要化學(xué)成分之一。優(yōu)良的纖維品質(zhì)有利于紡織和造紙工業(yè)等多用途產(chǎn)品的需要。剖析黃麻纖維纖維素含量的遺傳基礎(chǔ),有助于育種家選育纖維產(chǎn)量高且品質(zhì)優(yōu)良的新品種。為了提高黃麻纖維品質(zhì),需要通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)EST-SSR標記、構(gòu)建高密度圖譜遺傳圖譜,并進行纖維素含量QTL定位,從而來挖掘纖維品質(zhì)相關(guān)基因資源。本研究以長果種黃麻寬葉長果為材料,進行轉(zhuǎn)錄組測序特征分析并開發(fā)EST-SSR標記,并評估與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的EST-SSR的多態(tài)性;利用新開發(fā)的EST-SSR加密已有的SLAF連鎖圖譜的標記密度,并進行纖維素含量QTL定位。主要方法與結(jié)果如下:為了獲得長果種黃麻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),在黃麻植株生長旺盛期(播種后30天)采集了4個獨立的組織樣本(葉、根、莖桿和莖皮)進行總RNA提取,構(gòu)建4個測序文庫,利用Illumina技術(shù)進行RNA-seq。所獲得的測序數(shù)據(jù)通過Trinity軟件進行組裝,并在NCBI公共數(shù)據(jù)庫進行功能注釋;通過MISA軟件開發(fā)EST-SSR標記。為了評價新開發(fā)的EST-SSRs多態(tài)性,我們選取了110對位于轉(zhuǎn)錄因子(TFs)上的EST-SSR引物,以不同來源的24份黃麻材料,進行瓊脂糖凝膠電泳進行PCR產(chǎn)物檢測。為了豐富已有的SLAF遺傳連鎖圖譜的標記密度,利用上述的新開發(fā)的EST-SSR,結(jié)合課題組前期開發(fā)的In Del和SLAF,利用Join-Map軟件重新構(gòu)建重組自交系的遺傳連鎖圖譜。采用比色法(蒽酮法)對重組自交系的兩個階段(旺盛生長期和工藝成熟期)的纖維素含量進行了兩年(2017年和2018年)鑒定。利用ICImapping軟件進行纖維素含量QTL定位。由Illumina雙末端測序獲得128132782個clean讀序(4Gb)。從頭測序并裝配了70792條平均長度為752bp的unigenes。通過序列相似性檢索已知的蛋白質(zhì),27962(57.16%)的基因至少在一個公共數(shù)據(jù)庫注釋。在這些被注釋的功能基因中,27930(39.45%)和3387(47.84%)unigenes分別在GO和KOG注釋,有15201功能基因被映射到130 KEGG通路。其中,172基因參與與纖維素生物合成的淀粉和蔗糖的代謝途徑。在此基礎(chǔ)上,鑒定了纖維素生物合成相關(guān)基因,包括4個UGPase、10個CESA、55個CSL、14個SUS、1個KOR和4個COBRA。利用70792個unigene序列鑒定了1462對EST-SSR引物。其中,最豐富的重復(fù)類型是三核苷酸(53.6%)。三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型中以GA或AG重復(fù)為主,是黃麻基因組中最豐富的重復(fù)類型。利用包含轉(zhuǎn)錄因子的110對SSR引物分析其在24份黃麻種質(zhì)中的多態(tài)性。在多態(tài)性檢測中,102對引物在供試材料中擴增出帶型且都存在多態(tài)性,說明這些新開發(fā)的SSR引物質(zhì)量好。102對SSR的平均PIC值為0.38。102對多態(tài)性SSR引物成功地將24個黃麻種質(zhì)分為5個類群,表明這些品種(系)間存在較大的遺傳變異。整合課題組前期開發(fā)標記,利用585個SSR、5074個SLAFs和173個In Del標記重新構(gòu)建104份F8重組自交系群體的遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明,該遺傳連鎖圖譜全長604.5c M,包含835個標記,平均間距為2.84cm,7條連鎖群均發(fā)生偏分離現(xiàn)象。結(jié)合纖維素含量的表型數(shù)據(jù),進行QTL定位,兩年分別檢測到5個QTL和4個QTL,分別解釋14.46%和16.01%的表型變異。其中,q BFC1-1QTL在兩年中均能被穩(wěn)定檢測到,表現(xiàn)為主效QTL。本研究中,使用高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲得黃麻旺盛生長期莖皮的表達序列標簽并分析其特征;基于測序數(shù)據(jù)開發(fā)EST-SSR和識別黃麻莖皮旺盛生長期相關(guān)unigene;重新構(gòu)建已有的遺傳連鎖圖譜,定位一個纖維素含量主效QTL(q BFC1-1)。這些結(jié)果可為分子標記輔助育種提供資源,也可為黃麻纖維遺傳剖析和次生細胞壁發(fā)育奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S563.4
【部分圖文】：

Figure 2-1Length distributions of the assembled transcripts and unigenesin Corchorus olitoriThe horizontal axis is the length of transcripts and unigenes, and the vertical axis is the numbertranscripts and unigenes.圖 1-3 長果種黃麻的轉(zhuǎn)錄本和 unigenes 長度的頻率分布。橫軸是轉(zhuǎn)錄本和 unigenes 的長縱軸是轉(zhuǎn)錄本和 unigenes 的數(shù)量。Transcripts were de novo assembled into unigenes, producing 70792 unigenes withmean length of 752 bp and the N50 length of 1420 bp (Figure 2-1, Appendix 2). Tlength of these unigenes differed from 201bp to 13328bp. 43599 (61.58%) unigenwere in the length range of 201 to 500 bp and 11485 (16.2%) unigenes were in tlength range of 501 to 1000 bp, whereas15710 (22.2%) unigenes lengths were greathan1000 bp (Figure 2-1).To assess the quality of the assembled unigenes, de novo assembltranscriptome sequences by Trinity was considered as a reference sequence. All tclean sequence reads were mapped to the assembled unigenes by RSEM software[15

Figure 2- 2 Classification of most abundant annotated species.圖 2-2 基因注釋的主要物種分類2.3.3 GO annotationUnigenes assembled from GO annotated product combined with noninformation were obtained using blast2GO software[153]. The GO funccategorized according to the WEGO program[154]. As results, a tota(39.45%) unigenes based on GO, were categorized into 3 major categoriesfunction, biological process, and cellular component) and 56 subcategories3). Among the sub categories, the cellular process was most dominant unigenes, followed by, binding, metabolic process, catalytic activity , singlactivity, cell, and cell part with 15134, 14962, 12605, 12010, 8859, 615respectively. There were very few genes (less than 10) assigned to growthrhythmic process, extracellular matrix components, and nucleoid, synap

Figure 2- 3 Gene ontology classifications of assembled unigenes in jute.圖 2-3 黃麻 unigenes 的 GO 功能分類2.3.4 KOG annotationTo evaluate the integrity and validity of the transcriptome sequence, 33873(47.84%) unigenes annotated in the Nr database were assigned to the KOG databaseto categorize potential role. In total, 16993 (24%) genes were grouped into 26 KOGcategorizations (Figure 2-4). Of these categorizations, R (general function with 2646(13.9%) was the most abundant followed by O (post-translational modification,protein turnover), T (signal transduction mechanisms), J (translation, ribosomal,structure and biogenesis), C (energy production and conversion),U (intracellulartrafficking, secretion and vesicular transport with 2277 (11.96 %), 1559 (8.19%),1462 (7.68%), 1051 (5.52%) and 1041 (5.47), 928 (4.87%), 914 (4.80%) and 883(4.69%) genes respectively), whereas N (cell motility) and X (unnamed protein)which were less represented with 7 (0.03%) and 1 (0.01%) genes respectively.
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本文編號：2837272