隨著人民生活水平的提高,同時(shí)具有治療與預(yù)防作用的“藥食兩用”藥材受到人們廣泛關(guān)注。中藥材的真?zhèn)闻c藥用成分含量是保證藥材品質(zhì)與療效的基礎(chǔ)。一方面,近年來中藥產(chǎn)品中原料藥材摻假造假問題頻發(fā),嚴(yán)重阻礙了中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,進(jìn)一步影響了中藥在全球的聲譽(yù)。DNA條形碼已廣泛應(yīng)用于藥用植物、中藥材及飲片的鑒定,然而其不適合經(jīng)過各種深加工,導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解的中藥產(chǎn)品的鑒定。為解決DNA降解的材料的鑒定,本文提出了“分子身份證”的概念,即利用一段長(zhǎng)為20-50bp特異性短片段,對(duì)混合物中某特定物種進(jìn)行鑒定;本研究基于大樣本量ITS2序列分析,開發(fā)了正品當(dāng)歸及肉蓯蓉藥材混淆品(鎖陽、沙蓯蓉、列當(dāng)及草蓯蓉)的分子身份證,并為當(dāng)歸、肉蓯蓉產(chǎn)品的快速準(zhǔn)確鑒定提供了依據(jù)。(1)當(dāng)歸是常見婦科用藥,本文收集了 265份當(dāng)歸及其近緣種、混淆品樣品。對(duì)ITS2序列進(jìn)行分析,找到了當(dāng)歸特有的SNP位點(diǎn),開發(fā)了一段長(zhǎng)為37-bp的“分子身份證”片段(5'-AATCCGCGTCATCTTAGTGA GCTCAAGGAC CCTTAGG-3'),應(yīng)用網(wǎng)上當(dāng)歸屬72個(gè)物種的573條序列,對(duì)此“分子身份證”進(jìn)行驗(yàn)證,證實(shí)為當(dāng)歸特有序列,未知物種與當(dāng)歸分子身份證序列100%一致,則判斷為當(dāng)歸,若存在一個(gè)堿基以上的變異,則判斷不是當(dāng)歸,并設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲取此分子身份證區(qū)域。對(duì)當(dāng)歸粉、提取物和中成藥的鑒定結(jié)果表明:網(wǎng)上購(gòu)買的14份當(dāng)歸粉中,有7份被獨(dú)活替代。對(duì)28批含當(dāng)歸中成藥中,僅19個(gè)批次可判斷含有當(dāng)歸,其他批次中還檢出了獨(dú)活、羌活等非標(biāo)簽成分。(2)肉蓯蓉是常見滋補(bǔ)佳品,來源于肉蓯蓉及管花肉蓯蓉兩種基原植物。本文對(duì)251份肉蓯蓉和混淆品樣品進(jìn)行了 DNA提取,同NCBI中325條相關(guān)ITS2序列共同分析。以四種常見混淆品(鎖陽、沙蓯蓉、列當(dāng)及草蓯蓉)的SNP位點(diǎn)為基礎(chǔ),分別開發(fā)了 4個(gè)長(zhǎng)度范圍在30～37bp的肉蓯蓉混淆品的“分子身份證”,并設(shè)計(jì)了 6對(duì)物種特異性引物擴(kuò)增獲取分子身份證區(qū)域,對(duì)66種肉蓯蓉提取物和中成藥的鑒定結(jié)果表明:“分子身份證”可成功鑒定混合物中的目標(biāo)物種,約36.4%的產(chǎn)品中檢測(cè)到非標(biāo)簽成分,其中肉蓯蓉中摻雜鎖陽是市場(chǎng)最常見現(xiàn)象。除此之外,如何提高藥材品質(zhì)與療效也是當(dāng)前研究的熱點(diǎn),提高藥用成分即藥材中次生代謝產(chǎn)物的含量成為其中的研究方向之一�！八幨硟捎谩彼幉拇ㄘ惸纲Y源匱乏,被列入國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物名單。近年霧霾天氣頻發(fā),更加劇了對(duì)其資源的需求。其活性成分貝母辛、貝母甲素等屬于異甾體類生物堿,目前關(guān)于其生物合成途徑尚不明確。太白貝母(Fritillaria taipaiensis)是適合低海拔栽種的川貝母基原物種,且甾體生物堿種類含量與川貝母一致。長(zhǎng)期以來,一直缺乏對(duì)太白貝母基因組、轉(zhuǎn)錄組及其相關(guān)基因的研究。(1)本研究對(duì)太白貝母進(jìn)行了首次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。利用2×125 Pair End Illumina測(cè)序獲得的94,396,694(～11.4 Gb)高質(zhì)量reads,共組裝成190,350個(gè)轉(zhuǎn)錄本。利用多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋,識(shí)別出一系列與甾體類生物堿生物合成相關(guān)的基因,以及其他次生代謝產(chǎn)物途徑,包括甾醇和萜類生物合成途徑,以及重要的下游氧化還原酶(如CYP450s)。(2)使用qRT-PCR對(duì)甾體類生物堿合成相關(guān)酶基因進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明這些候選基因參與了組織特異性表達(dá)。通過對(duì)表達(dá)結(jié)果的分析,相對(duì)于葉片而言,鱗莖更有可能是甾體類生物堿上游生物合成途徑的主要部位,同時(shí)推測(cè)包括CYP450s等催化氧化還原反應(yīng)在內(nèi)的下游反應(yīng)可能也發(fā)生在鱗莖中。(3)本文成功構(gòu)建了甾體生物堿合成途徑上的5個(gè)關(guān)鍵酶——HMGS,HMGR,DXS,ispH,CAS以及待選的氧化還原酶包括CYP450超家族酶(CYP90B1、CYP90D2),DWF5,DWF1,FK的基因及釀酒酵母或大腸桿菌的表達(dá)載體,并誘導(dǎo)了表達(dá)載體的蛋白表達(dá),同時(shí)探討了不同誘導(dǎo)條件對(duì)蛋白表達(dá)的影響。綜上,本研究從兩個(gè)角度對(duì)“藥食兩用”藥材進(jìn)行了研究,一方面開發(fā)了當(dāng)歸正品及肉蓯蓉四種混淆品分子身份證,并建立了分子身份證鑒定中成藥的方法,進(jìn)一步拓寬了 DNA條形碼的研究范疇;另一方面建立的完整的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)將作為一個(gè)資源,用于識(shí)別潛在的候選基因操作靶向生物活性代謝物,也有助于開發(fā)功能相關(guān)的分子標(biāo)記,加快對(duì)太白貝母的分子育種和保護(hù)工作。本文已構(gòu)建成功了多個(gè)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)載體,后續(xù)將對(duì)其催化活性進(jìn)行分析并確定其功能,為進(jìn)一步研究甾體生物堿的生物合成奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

保健食品劑型主要包括膠囊、口服液、含片以及保健茶等。??中藥材作為中華民族的瑰寶，“藥食兩用”藥材從采收、收購(gòu)、加工、銷售等??各個(gè)環(huán)節(jié)中（圖１－１），影響藥材質(zhì)量的因素主要有品種真?zhèn)闻c質(zhì)量?jī)?yōu)劣兩個(gè)方面，??其中藥材真?zhèn)问腔A(chǔ)，必須首先保證藥材的正確性�！八幨硟捎谩彼幉臒o論藥用還是??食用，多被制成各類劑型，如丸劑、散劑和膠囊劑等，其加工工藝繁雜，導(dǎo)致產(chǎn)品??原料鑒定困難，極易產(chǎn)生摻偽混偽的情況，為保障消費(fèi)者健康，鑒定“藥食兩用”??藥材的真?zhèn)问种匾�。其次要注重藥材的質(zhì)量，包括有效成分含量、農(nóng)殘及重金屬??污染以及真菌毒素等。“藥食兩用”藥材的品質(zhì)和療效是其保健及藥用功能的基礎(chǔ)，??其中主要藥用成分對(duì)評(píng)估藥材的品質(zhì)和療效至關(guān)重要。藥用成分是藥材在生長(zhǎng)發(fā)育??和適應(yīng)生境過程中，受到環(huán)境中特定因子的誘導(dǎo)而響應(yīng)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物??（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）?［１２］，這類物質(zhì)是鑒定藥材品質(zhì)的重要指標(biāo)之一【１３］。一直以??來

歸及三七ＤＮＡ。首先檢驗(yàn)特異性引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ在此中成藥中的擴(kuò)增效率，結(jié)??果顯示在２個(gè)批次的活血止痛膠囊中，含有當(dāng)歸“分子身份證”序列的短片段均可??被成功擴(kuò)增（圖２－３，表２－４）。??在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)其它２６批次含當(dāng)歸的中成藥進(jìn)行了鑒定，主要包括烏??雞白鳳丸、跌打丸及人參健脾丸等，成分表細(xì)節(jié)見表２－５。２６批次中成藥有２４批次??得到擴(kuò)增結(jié)果，引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ的ＰＣＲ擴(kuò)增效率和測(cè)序成功率為９２．８６％?（圖??２－３）。其中，人參再造丸收錄在中國(guó)藥典（２０１５年版），在所涉及的中成藥中組方成??分最復(fù)雜。除當(dāng)歸外，該中成藥還含有人參，廣藿香，檀香等５５種藥材成分。特異??性引物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ在如此復(fù)雜的成分中，仍優(yōu)先擴(kuò)增當(dāng)歸的“分子身份證”序??列，并得到較好的測(cè)序結(jié)果�？沙晒Λ@得擴(kuò)增條帶的２４批次樣品中，１７批次樣品??的ＰＣＲ產(chǎn)物Ｓａｎｇｅｒ測(cè)序結(jié)果可以檢測(cè)到當(dāng)歸“分子身份證”區(qū)域

?－?ｖａｊ??〇〇?ｂｐ?ｉ?〇〇?ｈｒ??圖２－２當(dāng)歸煎煮物及提取物ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ及ＩＴＳ２引物擴(kuò)增結(jié)果圖??除Ｍａｒｋｅｒ?（Ｍ）夕卜，１￣６泳道對(duì)應(yīng)ＤＧ０１Ｆ／ＤＧ０１Ｒ擴(kuò)增產(chǎn)物，７？１２泳道對(duì)應(yīng)ＩＴＳ２序??列。每對(duì)引物中的第一泳道（１和７）是陰性對(duì)照；第二泳道（２和８）是未經(jīng)過煎??煮的當(dāng)歸樣品陽性對(duì)照；第三至第五泳道（３￣５及９￣１１）是經(jīng)過煎煮的當(dāng)歸樣品ＰＣＲ??產(chǎn)物，煎煮時(shí)間分別為１２０分鐘，１８０分鐘和２４０分鐘；第六泳道（６和１２）是來??自當(dāng)歸提取物粉末的ＰＣＲ產(chǎn)物。??市售含當(dāng)歸成分的中成藥有許多種，大多數(shù)配方十分復(fù)雜，本研究首先選擇配??方組分較簡(jiǎn)單的活血止痛膠囊進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證本研究開發(fā)的當(dāng)歸分子身份證能否??成功應(yīng)用于成分較簡(jiǎn)單的中成藥。活血止痛膠囊共含有六種成分，除當(dāng)歸外，還包??括三七（Ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ?Ｒａｄｉｘ?ｅｔＲｈｉｚｏｍａ），乳香（Ｏｌｉｂａｎｕｍ），冰片（Ｂｏｒｎｅｏｌｕｍ??Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｕｍ），土鱉蟲（ＥｕｐｏｌｙｐｈａｇａＳｔｅｌｅｏｐｈａｇａ）和自然銅（Ｐｙｒｉｔｕｍ）。其中，乳香、??冰片及自然銅分別屬于分泌物類藥材、重結(jié)晶化合物及礦物類藥材

本文編號(hào)：2835783