靈芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst),是靈芝科(Ganodermataceae)靈芝屬(Ganoderma)中的一種藥用真菌,具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌和增強(qiáng)免疫力等藥理活性。由于靈芝具有重要的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,培育其優(yōu)良品種和改善其藥用品質(zhì)一直以來(lái)是研究熱點(diǎn)。非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)在編碼蛋白基因表達(dá)的各個(gè)水平發(fā)揮著重要的作用。本文利用鏈特異性轉(zhuǎn)錄組(strand specificRNA-seq,ssRNA-seq)數(shù)據(jù),結(jié)合前期對(duì)靈芝基因間區(qū)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long intergenic non-coding RNA,lincRN A)的工 作基礎(chǔ),對(duì)靈芝天然反義轉(zhuǎn)錄本(Natural Antisense Transcripts,NATs)和環(huán)狀 RNA(circularRNA,circRNAs)進(jìn)行了系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn),并對(duì)NATs和circRNAs之間的相互作用進(jìn)行了深入地分析,主要研究結(jié)果如下:(1)NATs生物信息學(xué)分析流程的建立�；趐erl編程語(yǔ)言及第三方生物信息學(xué)分析軟件,結(jié)合ssRNA-seq數(shù)據(jù)建立了 NATs生物信息學(xué)分析流程—NATs-finder。該分析流程包括三個(gè)分析模塊,分別用以發(fā)現(xiàn):順式天然反義轉(zhuǎn)錄本(cis-NATs)、反式天然反義轉(zhuǎn)錄本(trans-NATs)以及非編碼的cis-NATs和trans-NATs。(2)靈芝NATs的發(fā)現(xiàn)及功能解析。利用NATs-finder生物信息學(xué)分析流程,在靈芝菌絲、原基和子實(shí)體三個(gè)發(fā)育階段樣品的ssRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了 1613條cis-NATs和244條trans-NATs。并以25對(duì)與靈芝生長(zhǎng)發(fā)育、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成具有緊密關(guān)聯(lián)的正義—反義轉(zhuǎn)錄本對(duì)(Sense-Antisese-Transcripts,SATs)作為主要研究對(duì)象,利用鏈特異性熒光定量PCR(strand specific RT-qPCR,ssRT-qPCR)實(shí)驗(yàn)手段檢測(cè)SATs在三個(gè)發(fā)育階段樣品中的相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)60%轉(zhuǎn)錄本的檢測(cè)結(jié)果與在 ssRNA-seq 數(shù)據(jù)中的檢測(cè)結(jié)果相一致(Pearson correlation coefficient,r ≥ 0.9);其次,88%SATs表達(dá)譜間的相關(guān)性具有顯著性差異(p≤0.01),且15對(duì)SATs表達(dá)譜間的 r≥0.8,4 對(duì) SATs 的 r≤-0.8。600 條正義轉(zhuǎn)錄本(SeneseTranscripts,STs)被映射到409個(gè)GO terms,14個(gè)GO terms為顯著性富集,其中4個(gè)GO terms的特異性富集具有顯著性差異(q0.05)。168個(gè)STs被映射到196條KEGG Pathways中,65條Pathways為顯著性富集,其中5條Pathways的特異性富集具有顯著性差異(q0.05)。根據(jù)STs的功能富集、SATs表達(dá)譜間的相關(guān)性等分析結(jié)果,本文推斷NATs極有可能對(duì)參與靈芝木質(zhì)素降解途徑中的乙醇氧化酶(Alocohol oxidase)、乙醛乙醇氧化酶(Aryl Alcohol oxidase,AAO)、纖維素二糖脫氫酶(cellobiose dehydrogenase,CDH)等關(guān)鍵酶具有顯著的調(diào)控作用。(3)靈芝circRNAs的發(fā)現(xiàn)及功能解析。在RNase R和lncRNA兩種建庫(kù)方法的ssRNA-seq數(shù)據(jù)中分別發(fā)現(xiàn)2193和250個(gè)靈芝circRNAs。并以在RNase R建庫(kù)方法獲得的ssRNA-seq數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)的具有表達(dá)的的外顯子來(lái)源circRNAs(exonic circRNAs)作為主要分析內(nèi)容:在總計(jì)發(fā)現(xiàn)的731個(gè)exonic circRNAs中,挑選出10個(gè)與靈芝生長(zhǎng)發(fā)育緊密相關(guān)的候選exonic circRNAs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,5個(gè)候選exonic circRNAs被PCR擴(kuò)增出目的條帶,其中3個(gè)候選exonic circRNAs被Sanger測(cè)序證實(shí)具有反式剪接位點(diǎn)(back-spliced sites)。177個(gè)exonic circRNAs在靈芝菌絲、原基和子實(shí)體三個(gè)發(fā)育階段間的差異表達(dá)較為顯著(q0.05),119個(gè)exonic circRNAs(16.3%)與源基因表達(dá)譜間的相關(guān)性為顯著的正相關(guān)(r≥0.9,q0.01),而226個(gè)exonic circRNAs(30.9%)與源基因表達(dá)譜間的相關(guān)性為顯著的負(fù)相關(guān)(r≤-0.9,q0.01)。731個(gè)exoniccircRNAs對(duì)應(yīng)561個(gè)源基因,其中380個(gè)源基因被映射到335個(gè)GO terms中,64個(gè)GO terms為顯著性富集(q0.05),其中37個(gè)GO terms的特異性富集具有顯著性差異(q0.05)。192個(gè)源基因被映射到208條KEGGPathways,73 條 KEGGPathways 為顯著性富集,其中 28 條 KEGGPathways的特異性富集具有顯著性差異(q0.05)。由源基因的功能富集及源基因與exonic circRNAs表達(dá)譜間的相關(guān)性等研究結(jié)果顯示:exonic circRNAs對(duì)靈芝三萜類合成MVA途徑中的戊二酰輔酶A(glutaryl coenzyme A)、多糖類合成途徑中的GTP結(jié)合蛋白R(shí)ho1(GTP-binding protein rho1)均具有顯著地調(diào)控作用。(4)靈芝源基因與NATs、circRNAs的互作分析。源基因、cis-NATs與exonic circRNAs之間具有多種相互作用關(guān)系:exonic circRNAs可抑制cis-NATs,進(jìn)而降低cis-NATs對(duì)源基因的正調(diào)控;exonic circRNAs也可與cis-NATs發(fā)生協(xié)同作用,共同抑制或者促進(jìn)源基因的表達(dá),且源基因與cis-NATs、exonic circRNAs之間的相互作用與源基因和cis-NATs的構(gòu)象關(guān)系、三者之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系等密切相關(guān)。另外,由源基因的功能富集分析結(jié)果顯示:cis-NATs和exonic circRNAs對(duì)參與靈芝氧化還原反應(yīng)、次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成等相關(guān)的源基因具有顯著的調(diào)控作用。本文的研究結(jié)果不僅填補(bǔ)了靈芝NATs和circRNAs的研究空白,更為研究參與靈芝生長(zhǎng)發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的編碼蛋白基因的調(diào)控作用開辟了新的道路。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.31
【部分圖文】：

均長(zhǎng)度為９００?ｎｔ，４１％的ＮＡＴｓ在對(duì)應(yīng)的ＳＴｓ的ＯＲＦ內(nèi)，３４％的ＮＡＴｓ與Ｓ３’的相對(duì)位置關(guān)系［７４］。??ＡＴｓ的典型特征??根據(jù)ＮＡＴｓ來(lái)源的不同，可將其分為：順式ＮＡＴｓ?（ｃｉｓ－ＮＡＴｓ）和反式ＮＡＴｓ?（ｔＴｓ）。ｃｉｓ－ＮＡＴｓ與ＳＴｓ位于參考基因組同一位置，并且在序列上與ＳＴｓ呈完互補(bǔ)。根據(jù)與ＳＴｓ重疊的相對(duì)方向，又可將ｃｉｓ－ＮＡＴｓ分為三種構(gòu)象：頭對(duì)頭５’－５’）、尾對(duì)尾重疊（３’－３’）和完全重疊３種形式（圖卜１Ａ－Ｃ）。５’－５’即是起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（５’）與ＮＡＴｓ的起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（５’）重疊，其中包括了?５’非、外顯子、內(nèi)含子（圖１－１?Ａ）。３’－３’即是指ＳＴｓ的末端轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（３’）與ＮＡ轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)（３’）重疊，其中也包括３’非翻譯區(qū)、外顯子和內(nèi)含子（圖１－１全重疊即是在參考基因組上ＳＴｓ包含ＮＡＴｓ或者ＮＡＴｓ包含ＳＴｓ?（圖１－１?Ｃ）ｎｓ－ＮＡＴｓ與ＳＴｓ位于參考基因組不同位置，且與ＳＴｓ的重疊部分短、不完全［７８］。??Ａ??

從菌絲到原基的發(fā)育，溫度應(yīng)控制在２５？２８?°Ｃ之間，不能低于２０?°Ｃ或則培養(yǎng)料表面菌絲會(huì)萎黃，并且生長(zhǎng)極為緩慢�？諝庀鄬�(duì)濕度應(yīng)控制在一般從菌絲發(fā)滿整個(gè)菌袋到出現(xiàn)原基需要培養(yǎng)２０天。當(dāng)一個(gè)菌袋內(nèi)長(zhǎng)時(shí)，用剪刀剪去多余的原基。僅留下１－２個(gè)原基繼續(xù)生長(zhǎng)。??體的收集??基到子實(shí)體的培養(yǎng)過(guò)程中，溫度應(yīng)控制在２７－２９?°Ｃ，空氣濕度應(yīng)控制在８于８０％不利于子實(shí)體生長(zhǎng)，并且容易致死細(xì)嫩的原基；而高于９５％時(shí)，雜菌。靈芝屬于好氣型真菌，隨著原基的分化增大，既要保溫保濕，又。Ｃ〇２濃度過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生畸形靈芝。因此大棚內(nèi)部每天需要通風(fēng)２？３次，ｉｎ以上。。當(dāng)子實(shí)體己充分展開不再長(zhǎng)大，淺白色邊緣消失，邊緣顏色變菌蓋木栓化，變硬并且有光澤，同時(shí)子實(shí)體表面或袋口有褐紅色粉狀孢，則表示子實(shí)體已經(jīng)成熟，可及時(shí)采收，用剪刀或手輕輕向上一提即可１）。??

３．１?ＲＮＡ定性檢測(cè)??由瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果得知，ＲＮＡ樣品中的２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ條帶清晰，沒??有彌散、降解現(xiàn)象，可以用于鏈特異性建庫(kù)、測(cè)序（圖２－２）。??Ｍ?１?２?３?４?５?６?７?８?９??圖２－２靈芝菌絲、原基及子實(shí)體ＲＮＡ樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｔｈｅ?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?Ｇ．?ｌｕｃｉｄｕｍ?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ??說(shuō)明：ＭＤＮＡ２０００?Ｍａｒｋｅｒ；?ｌａｎｅ?１－３：菌絲?ＲＮＡ?樣品，ｌａｎｅ?４－６：原基?ＲＮＡ?樣??品，ｌａｎｅ?７－９：子實(shí)體ＲＮＡ樣品。??Ｎｏｔｅｓ：?Ｍ：?Ｓｔａｎｄａｒｄ?２０００ｂｐ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?ｌａｎｅ?１－３：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｍｙｃｅｌｉａ；??ｌａｎｅ?４－６：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｐｒｉｍｏｒｄｉａ；?ｌａｎｅ?７－９：?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ｆｒｏｍ?ｆｍｉｔｉｎｇ?ｂｏｄｉｅｓ．??３．２?ＲＮＡ定量檢測(cè)??我們利用ＮａｎｏＤｉ＊ｏｐ２０００核酸定量?jī)x對(duì)ＲＮＡ樣品的濃度和純度進(jìn)行了檢測(cè)（表??２－１）。結(jié)果顯示，每管樣品的體積為５０ｕｌ，總量２?１０ｕｇ，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比值均大??于１．８，?ＯＤ２６０／ＯＤ２３０比值均大于２．０，樣品濃度及純度滿足鏈特異性文庫(kù)構(gòu)建的要??求。??表２－１?ＲＮＡ樣品濃度和純度的檢測(cè)結(jié)果??Ｔａｂｌｅ?２－１?Ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｐｕｒｉｔｙ?ｏｆ?ＲＮＡ?ｓａｍｐｌｅｓ?ａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅ
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2835675