發(fā)布時(shí)間：2020-09-21 17:55

　　 研究野生大豆的抗旱機(jī)制和獲取抗旱型基因,對(duì)于改良大豆品質(zhì)有重要意義。本論文以實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)多年篩選的抗旱性較強(qiáng)的野生大豆永46為試驗(yàn)材料,用20%PEG6 000模擬干旱,分別在處理0h、6h、12h、24h和48h剪取野生大豆葉片,提取總RNA,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。分析結(jié)果表明,大量的差異表達(dá)基因響應(yīng)干旱脅迫。從中篩選了5個(gè)基因進(jìn)行功能驗(yàn)證,為野生大豆抗旱基因挖掘和重要代謝途徑確定提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共獲得39 183條轉(zhuǎn)錄本,5個(gè)時(shí)期共有的轉(zhuǎn)錄本為27 875條。其中在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋的轉(zhuǎn)錄本有24 656條,在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋的轉(zhuǎn)錄本有19 780條,在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋的轉(zhuǎn)錄本有35 534條,其中3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)均有注釋的轉(zhuǎn)錄本有16 937條,都不能注釋的轉(zhuǎn)錄本有1 867條。2.選取了7個(gè)基因進(jìn)行了熒光定量分析來(lái)確定轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。每個(gè)基因驗(yàn)證5個(gè)時(shí)期。其中4個(gè)基因每個(gè)時(shí)期的RT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果的表達(dá)趨勢(shì)完全一致;2個(gè)基因的比對(duì)結(jié)果基本一致,1個(gè)基因表達(dá)趨勢(shì)完全相反,一致度可達(dá)77%。3.通過(guò)對(duì)5個(gè)不同時(shí)期差異表達(dá)基因分析,處理12h差異表達(dá)基因最多,為12 289個(gè);處理48h最少,為2 841個(gè)。在4個(gè)處理樣本中均表現(xiàn)為差異表達(dá)的基因數(shù)有5 346個(gè),在Pathway代謝注釋的途徑中富集程度最高的途徑有6條。4.根據(jù)RNA-Seq結(jié)果獲得的基因表達(dá)量和功能注釋結(jié)果,結(jié)合生物信息學(xué)分析,共篩選了5個(gè)抗旱候選基因。對(duì)候選基因進(jìn)行了克隆,在NCBI完成注冊(cè)(注冊(cè)號(hào):MH932277-MH932281)。通過(guò)對(duì)核酸序列的同源性進(jìn)行比較,克隆序列與野生大豆或大豆同源性較高,在進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)分析時(shí)發(fā)現(xiàn),克隆蛋白多為親水性蛋白。5.對(duì)5個(gè)基因進(jìn)行了過(guò)表達(dá)驗(yàn)證,其中對(duì)干旱脅迫最相關(guān)的基因是glysoja_008314。
【學(xué)位單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：S565.1
【部分圖文】：

圖 2-1 RNA-Seq 試驗(yàn)流程圖Fig.2-1 Principle and procedure of RNA-Seq1.去除雜質(zhì)數(shù)據(jù) 測(cè)序原始圖像轉(zhuǎn)化后形成的序列數(shù)據(jù)稱為原始數(shù)據(jù)（raw data）。數(shù)據(jù)過(guò)濾（filtering）后方可進(jìn)行測(cè)序。過(guò)濾后的數(shù)據(jù)稱為過(guò)濾數(shù)據(jù)（clean data）。過(guò)濾掉的轉(zhuǎn)錄本包括含有 adapter 序列的轉(zhuǎn)錄本，N 比例大于 10%的轉(zhuǎn)錄本以及低質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄本。過(guò)濾后的數(shù)據(jù)將進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量分析（QC）。2.比對(duì)參考序列 將過(guò)濾后的轉(zhuǎn)錄本分別比對(duì)到大豆 william82 基因組和基因序列（alignment with gene/genome reference），根據(jù)基因組可視化（Genome alignment visualization）、統(tǒng)計(jì)比對(duì)率（map rate statistics）、轉(zhuǎn)錄本在參考序列上的分布情況（distribution of reads on gene）、測(cè)序飽和度分析（Sequencing saturation）以及轉(zhuǎn)錄本在參考基因組上的分布情況（distribution of reads and genes on genome）結(jié)果判斷片段的質(zhì)量（QC ofalignment）。通過(guò)的 clean reads 進(jìn)行下一步的分析。

第二章 野生大豆干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）分析續(xù)表Continue樣品 Sample 0 h 6 h 12 h 24 h 4唯一定位序列Unique Match8 310 074 8 252 163 8 621 802 8 302 300 8 086 8多定位序列Multiple Match2 332 172 2 459 240 1 886 329 2 371 174 2 301 62.3.3 測(cè)序飽和度分析測(cè)序飽和度分析可以在一定程度上判斷測(cè)序數(shù)據(jù)量是否滿足要求。5 個(gè)同時(shí)期的樣品測(cè)序量在 12500k 后曲線趨于平緩（圖 2-2），表明此時(shí)測(cè)序達(dá)到了飽和狀態(tài)，測(cè)序量可以達(dá)到要求。A B

圖 2-3 各時(shí)期的序列數(shù)量統(tǒng)計(jì)維恩圖Fig.2-3 Venn diagram of unigenes under the different p表達(dá)基因定義對(duì)各個(gè)時(shí)期涉及的所有顯著差同時(shí)期兩兩比較下的差異基因個(gè)數(shù)如圖 2-4。比較，處理 12h 時(shí)差異表達(dá)基因個(gè)數(shù)最多，少，且處理 12h 差異上調(diào)基因最多，處理 6h兩兩比較中，與處理 12h 比較時(shí)差異基因最12h 比較時(shí)差異上調(diào)基因最多，處理 24h 和 4因最少；處理 24h 和 48h 比較時(shí)差異基因個(gè)

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本文編號(hào)：2823807