大豆是世界五大作物之一,是重要的糧油兼用作物。大豆生長過程中需水量較多,對(duì)缺水極其敏感。干旱嚴(yán)重影響大豆的生長發(fā)育,給大豆造成減產(chǎn)及品質(zhì)的下降。植物抗旱是一個(gè)復(fù)雜的過程,單個(gè)基因無法完成。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)一系列與抗旱相關(guān)基因的表達(dá),可以達(dá)到抗旱的目的。DREB類轉(zhuǎn)錄因子是近年來研究最廣泛的一類轉(zhuǎn)錄因子,是一類能夠與真核生物啟動(dòng)子區(qū)域的DRE/CRT順式作用原件發(fā)生特異性結(jié)合,從而誘導(dǎo)與抗旱相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。研究表明,DREB類轉(zhuǎn)錄因子參與多種植物的非生物脅迫應(yīng)答,能顯著提高植株的抗旱性。本研究將T_4代轉(zhuǎn)TaDREB3a基因大豆株系與對(duì)照株系分別開展芽期PEG模擬干旱處理和PCR鑒定,獲得5個(gè)陽性TaDREB3a過表達(dá)株系;于苗期和花期分別進(jìn)行干旱脅迫處理,根據(jù)表型以及測(cè)得的相對(duì)含水量、相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量等生理指標(biāo),利用抗旱隸屬函數(shù)值對(duì)5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系劃分抗旱級(jí)別,確定抗旱性較強(qiáng)的2個(gè)株系;對(duì)這2個(gè)株系的T_5代株系進(jìn)行基因的RNA表達(dá)水平分析,系統(tǒng)測(cè)定SOD、POD、CAT、丙二醛、脯氨酸等抗旱生理指標(biāo),同時(shí)調(diào)查分析株高、莢數(shù)、粒數(shù)、根長等農(nóng)藝性狀差異顯著性,鑒定出穩(wěn)定遺傳抗旱表達(dá)的轉(zhuǎn)TaDREB3a基因高世代株系。為明確TaDREB3a基因在干旱脅迫過程中的表達(dá)特點(diǎn)及建立大豆抗旱材料的鑒定體系奠定理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)利用聚乙二醇(PEG-6000)溶液模擬水分脅迫,對(duì)轉(zhuǎn)TaDREB3a基因的T_4代10份大豆材料進(jìn)行芽期抗旱性篩選,共篩選出6份抗旱性較好發(fā)芽率在90%以上的大豆株系。(2)通過PCR檢測(cè)、Bar基因試紙條檢測(cè)及聚乙二醇(PEG-6000)溶液模擬干旱等方式對(duì)芽期篩選得到的6份抗性株系進(jìn)行苗期抗旱性篩選,最終確定5個(gè)在苗期抗旱性較好的陽性株系。(3)采用盆栽干旱脅迫法,對(duì)轉(zhuǎn)TaDREB3a基因的T_4代、T_5代株系分別進(jìn)行苗期、花期抗旱性篩選,通過對(duì)轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系的表型、葉片相對(duì)含水量、電導(dǎo)率、葉綠素含量等生理指標(biāo)進(jìn)行隸屬函數(shù)劃分抗旱等級(jí),確定HL16-16-6、HL16-17-1為高抗株系。(4)對(duì)T_5代進(jìn)行熒光定量PCR分析表明,TaDREB3a基因在轉(zhuǎn)基因株系的各個(gè)部位均有表達(dá),葉中的表達(dá)量最高,根中表達(dá)量次之;轉(zhuǎn)基因株系的TaDREB3a表達(dá)量隨脅迫加深呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)。(5)進(jìn)一步通過對(duì)T_5代轉(zhuǎn)基因株系HL16-16-6、HL16-17-1的SOD、POD、CAT、MDA、Pro等抗旱生理指標(biāo)分析以及農(nóng)藝性狀分析,證明HL16-16-6、HL16-17-1這2個(gè)株系在干旱脅迫下保水能力、抗氧化能力等都顯著高于對(duì)照株系,表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。
【學(xué)位單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S565.1
【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

Mix 酶(5U μL) 12.5 μL混合引物(1μM) 1 μL模板 DNA 1 μL水 10.5 μL總體積 25 μL程序：性 5 min（預(yù)變性） 30 s 30 s 35 個(gè)循環(huán) 30 s伸 7 min（終延伸）終止反應(yīng)瓊脂糖凝膠，待凝膠凝固后，吸取 6 μL 樣本進(jìn)行點(diǎn)樣，電泳儀電mA，進(jìn)行跑膠。因試紙條檢測(cè)

結(jié)果與分析分析大豆株系分子鑒定基因大豆株系的 PCR 鑒定因株系 DNA 為模板，以 Bar 引物為檢測(cè)引物，對(duì) T4代株最終有 10 個(gè)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系材料，分別為 HL16-16-14-2，HL16-15-1，HL16-16-6，HL16-17-1，HL16-18-5，HL1 10 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)一步檢測(cè)。

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本文編號(hào)：2823500