紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生的韌皮纖維植物,具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì),但前人尚未選育出在生產(chǎn)上有利用價(jià)值的雄性不育系和雜交種。2000年,周瑞陽教授在海南冬繁的紅麻野生種UG93(引自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所)中發(fā)現(xiàn)了雄性不育突變系UG93S;2008年,周瑞陽等選育出了世界上首個(gè)紅麻“三系”雜交種“紅優(yōu)1號(hào)”。此后又在UG93品種群體中發(fā)現(xiàn)了能保持UG93S雄性不育系UG93B,并選育出了質(zhì)核同源雄性不育系UG93A,為研究雄性不育核質(zhì)互作提供了良好的材料。本課題組的前期研究表明,線粒體基因atp6與紅麻CMS密切相關(guān);以紅麻atp6的CDS序列構(gòu)建酵母bait載體,通過酵母雙雜交文庫篩選出了紅麻轉(zhuǎn)錄因子HcMYC2a和HcMYC2b分別與ATP6互作,但是互作的核心區(qū)域尚不清楚。為了驗(yàn)證ATP6與HcMYC2a和HcMYC2b蛋白互作的功能區(qū)域,本研究采用Infusion DNA融合方法,以短截的atp6序列分別構(gòu)建酵母bait載體,以短截HcMYC2a和HcMYC2b序列分別構(gòu)建酵母prey載體。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)分別驗(yàn)證紅麻ATP6與HcMYC2a和HcMYC2b互作的核心功能區(qū)域,得出如下主要研究結(jié)果:(1)以紅麻UG93A和UG93B的cDNA為模板,采用Infusion DNA融合的方法分別構(gòu)建短截的酵母bait重組載體,分別為pGBKT7-atp6A-1,pGBKT7-atp6A-2,pGBKT7-atp6B-1和pGADT7-atp6B-2;同時(shí)構(gòu)建短截的酵母 prey 重組載體,分別為 pGADT7-HcMYC2a-1,pGADT7-HcMYC2a-2,pGADT7-HcMYC2b-1和pGADT7-HcMYC2b-2。(2)分別將上述酵母bait載體轉(zhuǎn)化Y2H感受態(tài),prey載體轉(zhuǎn)化Y187感受態(tài),通過對(duì)不同短截片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交檢測(cè),研究結(jié)果表明atp6A-2與HcMyc2b-1;atp6A-2與HcMYC2b-2;atp6B-1 與HcMYC2b-1 以及atp6B-2與HcMYC2a-1 雜交組合在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的培養(yǎng)基上長(zhǎng)藍(lán)斑,說明這些蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用,其所代表的短截片段轉(zhuǎn)錄蛋白為互作的核心區(qū)域。(3)采用Infusion DNA融合方法構(gòu)建C端雙分子熒光互補(bǔ)載體pSPYCE-atp6A,pSPYCE-atp6B,pSPYCE-HcMYC2aa,pSPYCE-HcMYC2ab,pSPYNE-HcMYC2bb以及N端雙分子熒光互補(bǔ)載體pSPYNE-atp6A,pSPYNE-atp6B,pSPYNE-HcMYC2aa,pSPYNE-HcMYC2ab,pSPYNE-H cMYC2bb。(4)將上述重組載體經(jīng)不同的組合方式分別注射本氏煙草葉片,研究結(jié)果表明,ATP6A與HCMyc2bb;ATP6B與HCMyc2aa;ATP6B與HCMyc2ab;以及ATP6B與HCMyc2bb共同注射的煙草葉片均發(fā)射黃色熒光信號(hào),表明這些蛋白在煙草葉片中發(fā)生互作。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S563.5
【部分圖文】：

邐的長(zhǎng)度為邋９７８邋ｂｐ，邋／／ｃＭｒＣ２ａ－２邋的長(zhǎng)度為邋１０４７邋ｂｐ邋的，逡逑Ｚ／ｃＭｙＣ２ｂ－ｌ的長(zhǎng)度為１０１１邋ｂｐ，ｉ／ｃＭｒＣ２６－２的長(zhǎng)度為８６１邋ｂｐ的基因，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期逡逑的目標(biāo)條帶一致，表明該條帶即為擴(kuò)增目的條帶（圖３－１）。逡逑圖３－１基因ＰＣＲ擴(kuò)增逡逑Ｍ，邋ＢＭ５０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－５，分別代表：叫？６／４－廠逡逑ＨｃＭＹＣ２ａ－２ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ邋ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ｃｉｔｐ６Ｂ－２，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２．逡逑３．１．２誘餌載體ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＴ７載體的酶切鑒定逡逑用Ｎｄｅｌ和Ｘｍａｌ酶分別對(duì)ＰＧＢＫＴ７和ＰＧＡＤＴ７載體進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖３－２所示，逡逑圖Ａ為ＰＧＢＫＴ７載體在酶切前后凝膠電泳結(jié)果，目的條帶大小與預(yù)期一致，圖Ｂ泳道逡逑Ｉ為已經(jīng)連接一段大約２０００邋ｂｐ基因的ＰＧＡＤＴ７載體，泳道２為切除該片段后的ＰＧＡＤＴ７逡逑載體

７５（）ｈｎ邋１逡逑圖３－３酵母質(zhì)粒菌液ＰＣＲ鑒定逡逑Ｍ，ＢＭ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分別代表：含邐扣／？＜１４－２？邋爐６５－７，ｆｌ爐６５－Ｌ邋／／ｃＡ／ＹＣ？ｆｌ－７，逡逑／／ｃＭＴＣ２ｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－廠邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的載體逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑３．１．４酵母雙雜交Ｍａｔｉｎｇ鑒定逡逑將含序列的酵母ｂａｉｔ重組質(zhì)粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐｒｅｙ重逡逑組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，將含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ的營(yíng)養(yǎng)逡逑缺陷性培養(yǎng)基，挑單克隆，培養(yǎng)菌液與含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ營(yíng)養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)逡逑基，挑單克隆的培養(yǎng)菌液進(jìn)行Ｍａｔｉｎｇ反應(yīng)，取Ｍａｔｉｎｇ反應(yīng)后菌液在４０ｘ的顯微鏡下進(jìn)逡逑行觀察

２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分別代表：含邐扣／？＜１４－２？邋爐６５－７，ｆｌ爐６５－Ｌ邋／／ｃＡ／Ｙｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－廠邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的載體逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑ｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑母雙雜交Ｍａｔｉｎｇ鑒定逡逑含序列的酵母ｂａｉｔ重組質(zhì)粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐ分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，將含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ養(yǎng)基，挑單克隆，培養(yǎng)菌液與含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ營(yíng)養(yǎng)缺陷克隆的培養(yǎng)菌液進(jìn)行Ｍａｔｉｎｇ反應(yīng)，�。停幔簦椋睿绶磻�(yīng)后菌液在４０ｘ的顯微呈現(xiàn)為三葉草或者米老鼠圖案的二倍體細(xì)胞，如圖３－４所示：逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2819167