紅麻(Hibiscus cannabinus L.)是一年生的韌皮纖維植物,具有強大的雜種優(yōu)勢,但前人尚未選育出在生產(chǎn)上有利用價值的雄性不育系和雜交種。2000年,周瑞陽教授在海南冬繁的紅麻野生種UG93(引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所)中發(fā)現(xiàn)了雄性不育突變系UG93S;2008年,周瑞陽等選育出了世界上首個紅麻“三系”雜交種“紅優(yōu)1號”。此后又在UG93品種群體中發(fā)現(xiàn)了能保持UG93S雄性不育系UG93B,并選育出了質(zhì)核同源雄性不育系UG93A,為研究雄性不育核質(zhì)互作提供了良好的材料。本課題組的前期研究表明,線粒體基因atp6與紅麻CMS密切相關(guān);以紅麻atp6的CDS序列構(gòu)建酵母bait載體,通過酵母雙雜交文庫篩選出了紅麻轉(zhuǎn)錄因子HcMYC2a和HcMYC2b分別與ATP6互作,但是互作的核心區(qū)域尚不清楚。為了驗證ATP6與HcMYC2a和HcMYC2b蛋白互作的功能區(qū)域,本研究采用Infusion DNA融合方法,以短截的atp6序列分別構(gòu)建酵母bait載體,以短截HcMYC2a和HcMYC2b序列分別構(gòu)建酵母prey載體。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術(shù)分別驗證紅麻ATP6與HcMYC2a和HcMYC2b互作的核心功能區(qū)域,得出如下主要研究結(jié)果:(1)以紅麻UG93A和UG93B的cDNA為模板,采用Infusion DNA融合的方法分別構(gòu)建短截的酵母bait重組載體,分別為pGBKT7-atp6A-1,pGBKT7-atp6A-2,pGBKT7-atp6B-1和pGADT7-atp6B-2;同時構(gòu)建短截的酵母 prey 重組載體,分別為 pGADT7-HcMYC2a-1,pGADT7-HcMYC2a-2,pGADT7-HcMYC2b-1和pGADT7-HcMYC2b-2。(2)分別將上述酵母bait載體轉(zhuǎn)化Y2H感受態(tài),prey載體轉(zhuǎn)化Y187感受態(tài),通過對不同短截片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行酵母雙雜交檢測,研究結(jié)果表明atp6A-2與HcMyc2b-1;atp6A-2與HcMYC2b-2;atp6B-1 與HcMYC2b-1 以及atp6B-2與HcMYC2a-1 雜交組合在SD/-Trp-Leu-His-Ade/AbA/X-α-gal的培養(yǎng)基上長藍(lán)斑,說明這些蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生相互作用,其所代表的短截片段轉(zhuǎn)錄蛋白為互作的核心區(qū)域。(3)采用Infusion DNA融合方法構(gòu)建C端雙分子熒光互補載體pSPYCE-atp6A,pSPYCE-atp6B,pSPYCE-HcMYC2aa,pSPYCE-HcMYC2ab,pSPYNE-HcMYC2bb以及N端雙分子熒光互補載體pSPYNE-atp6A,pSPYNE-atp6B,pSPYNE-HcMYC2aa,pSPYNE-HcMYC2ab,pSPYNE-H cMYC2bb。(4)將上述重組載體經(jīng)不同的組合方式分別注射本氏煙草葉片,研究結(jié)果表明,ATP6A與HCMyc2bb;ATP6B與HCMyc2aa;ATP6B與HCMyc2ab;以及ATP6B與HCMyc2bb共同注射的煙草葉片均發(fā)射黃色熒光信號,表明這些蛋白在煙草葉片中發(fā)生互作。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S563.5
【部分圖文】：

邐的長度為邋９７８邋ｂｐ，邋／／ｃＭｒＣ２ａ－２邋的長度為邋１０４７邋ｂｐ邋的，逡逑Ｚ／ｃＭｙＣ２ｂ－ｌ的長度為１０１１邋ｂｐ，ｉ／ｃＭｒＣ２６－２的長度為８６１邋ｂｐ的基因，擴增結(jié)果與預(yù)期逡逑的目標(biāo)條帶一致，表明該條帶即為擴增目的條帶（圖３－１）。逡逑圖３－１基因ＰＣＲ擴增逡逑Ｍ，邋ＢＭ５０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－５，分別代表：叫？６／４－廠逡逑ＨｃＭＹＣ２ａ－２ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ邋ｆ邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ＰＣＲ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ｃｉｔｐ６Ｂ－２，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２．逡逑３．１．２誘餌載體ｐＧＢＫＴ７和ｐＧＡＤＴ７載體的酶切鑒定逡逑用Ｎｄｅｌ和Ｘｍａｌ酶分別對ＰＧＢＫＴ７和ＰＧＡＤＴ７載體進(jìn)行酶切，結(jié)果如圖３－２所示，逡逑圖Ａ為ＰＧＢＫＴ７載體在酶切前后凝膠電泳結(jié)果，目的條帶大小與預(yù)期一致，圖Ｂ泳道逡逑Ｉ為已經(jīng)連接一段大約２０００邋ｂｐ基因的ＰＧＡＤＴ７載體，泳道２為切除該片段后的ＰＧＡＤＴ７逡逑載體

７５（）ｈｎ邋１逡逑圖３－３酵母質(zhì)粒菌液ＰＣＲ鑒定逡逑Ｍ，ＢＭ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分別代表：含邐扣／？＜１４－２？邋爐６５－７，ｆｌ爐６５－Ｌ邋／／ｃＡ／ＹＣ？ｆｌ－７，逡逑／／ｃＭＴＣ２ｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－廠邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的載體逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑Ｍ，邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ａ－２，逡逑ＨｃＭＹＣ２ｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑３．１．４酵母雙雜交Ｍａｔｉｎｇ鑒定逡逑將含序列的酵母ｂａｉｔ重組質(zhì)粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐｒｅｙ重逡逑組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，將含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ的營養(yǎng)逡逑缺陷性培養(yǎng)基，挑單克隆，培養(yǎng)菌液與含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ營養(yǎng)缺陷性培養(yǎng)逡逑基，挑單克隆的培養(yǎng)菌液進(jìn)行Ｍａｔｉｎｇ反應(yīng)，�。停幔簦椋睿绶磻�(yīng)后菌液在４０ｘ的顯微鏡下進(jìn)逡逑行觀察

２０００邋ｍａｒｋｅｒ；泳道邋１－８，分別代表：含邐扣／？＜１４－２？邋爐６５－７，ｆｌ爐６５－Ｌ邋／／ｃＡ／Ｙｆｌ－二邋／／ｃ：Ｍ７Ｃ２６－廠邋／／ｃＡ／７Ｃ２Ｚｋ？基因的載體逡逑Ｆｉｇ３－３邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｙｅａｓｔｓ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ逡逑ｓｅｎｔ邋ＢＭ２０００邋Ｍａｒｋｅｒ；邋Ｌａｎｅ邋１－８，邋ａｔｐ６Ａ－ｌ，邋ａｔｐ６Ａ－２，邋ａｔｐ６Ｂ－ｌ，邋ａｔｐ６Ｂ－２邋ＨｃＭＹＣ２ａ－ｌ，邋ＨｃＭｂ－ｌ，邋ＨｃＭＹＣ２ｂ－２邋Ｃａｒｒｉｅｒ．逡逑母雙雜交Ｍａｔｉｎｇ鑒定逡逑含序列的酵母ｂａｉｔ重組質(zhì)粒和含／／ｃＭｙＣ２0和７／ｃＭｒｃ＾序列的酵母ｐ分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)Ｙ２Ｈ和Ｙ１８７。其中，將含Ｙ２Ｈ的菌株涂布ＳＤ／－Ｔｒｐ養(yǎng)基，挑單克隆，培養(yǎng)菌液與含Ｙ１８７的菌株涂布的ＳＤ／－Ｌｅｕ營養(yǎng)缺陷克隆的培養(yǎng)菌液進(jìn)行Ｍａｔｉｎｇ反應(yīng)，�。停幔簦椋睿绶磻�(yīng)后菌液在４０ｘ的顯微呈現(xiàn)為三葉草或者米老鼠圖案的二倍體細(xì)胞，如圖３－４所示：逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鄭立雙;李向楠;孫城濤;劉紅羽;劉勛;賀明;呂文發(fā);;酵母雙雜交技術(shù)及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J];中國畜牧獸醫(yī);2013年09期

2 崔喜艷;張繼曉;竇瑤;孫小杰;尹悅佳;劉相國;;雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)分析玉米SSⅠ與PPDK1之間的蛋白互作[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2013年07期

3 金剛;牛英;唐向民;周瓊;周瑞陽;;紅麻野敗型CMS胞質(zhì)SNP分子標(biāo)簽的發(fā)掘[J];西北植物學(xué)報;2012年12期

4 吳建梅;李點姣;林荔輝;祁建民;林培清;李中站;;雜交紅麻產(chǎn)量性狀的遺傳效應(yīng)與雜種優(yōu)勢[J];福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版);2012年06期

5 周曉娟;趙瑞;王永勤;;洋蔥異源胞質(zhì)雄性不育候選基因atp6的克隆與表達(dá)分析[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2012年02期

6 陳鵬;周瑞陽;;紅麻線粒體中細(xì)胞質(zhì)雄性不育候選基因cox3的克隆與分析[J];生物技術(shù)通訊;2011年01期

7 劉驥;張秀娟;范建平;張子義;;酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用及進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年19期

8 李鐵強;吳永英;范洪臣;王立群;;酵母雙雜交系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];生物信息學(xué);2008年01期

9 周瑞陽;張新;張加強;甘正華;韋漢西;;紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育及雜種優(yōu)勢利用取得突破[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年01期

10 楊景華;張明方;;線粒體反向調(diào)控介導(dǎo)高等植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育發(fā)生機制[J];遺傳;2007年10期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 廖小芳;紅麻UG93A和UG93B線粒體基因組差異分析及CMS相關(guān)基因的發(fā)掘[D];廣西大學(xué);2015年

2 趙艷紅;紅麻atp9、atp6、atpA基因克隆、功能分析與分子標(biāo)簽發(fā)掘[D];廣西大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 刁勇;紅麻UG93細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的篩選、克隆及表達(dá)分析[D];廣西大學(xué);2016年

本文編號：2819167