microRNAs是一類內(nèi)源性,長約21nt的非編碼小分子RNA。研究表明miRNA作為一類負(fù)調(diào)控因子廣泛參與到植物生長發(fā)育的各種進(jìn)程中。近幾年來,高通量測序技術(shù)的廣泛利用,使植物中大量的miRNA被發(fā)現(xiàn)和鑒定,這大大擴(kuò)展了植物miRNA群體中miRNA的種類和數(shù)量。然而,紅麻作為重要的韌皮纖維作物,目前還沒有關(guān)于紅麻miRNA的報(bào)道。本研究以紅麻不育系UG93A和保持系UG93B花藥為樣品,分別建立small RNA文庫,使用高通量測序技術(shù)鑒定紅麻保守的miRNA和新的miRNA,對不育系和保持系花藥中的miRNA的表達(dá)譜進(jìn)行分析,并對它們的靶基因進(jìn)行預(yù)測,最后對紅麻miR394a,miRn20,miR167b的功能進(jìn)行進(jìn)一步的研究,初步研究結(jié)果如下:1.通過高通量測序獲得了 42個(gè)保守的miRNA和41個(gè)新的miRNA。其中有14個(gè)miRNA在UG93A和UG93B的花藥中差異表達(dá)。使用Targetfinder軟件對miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測,共預(yù)測到280個(gè)靶基因,其中差異表達(dá)的miRNA的靶基因有79個(gè)。通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這些靶基因大部分為轉(zhuǎn)錄因子,如SPL轉(zhuǎn)錄因子、GATA轉(zhuǎn)錄因子、亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子、NAC轉(zhuǎn)錄因子。此外,還有一些酶,如鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶、肉桂醇脫氫酶、糖基轉(zhuǎn)移酶等。2.以紅麻H3基因作為內(nèi)參基因,隨機(jī)挑選10個(gè)miRNA,采用熒光染料嵌合法(qRT-PCR)對高通量測序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證分析。結(jié)果表明,高通量測序結(jié)果可靠。3.以DNA為模板克隆miR394a,miRn20,miR167b前體基因序列。使用mfold在線軟件分析,發(fā)現(xiàn)其前體序列能形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)。采用雙酶切法成功構(gòu)建miR394a,miRn20,miR167b的過表達(dá)載體。4.利用改良的CRISPR/Cas9多靶點(diǎn)載體系統(tǒng),采用Golden Gate Cloning 方法分別構(gòu)建 miR394a,miRn20,miR167b 的pYLCRISPR/Cas9 載體,將其分別命名為:pCas9-miR394,pCas9-miRn20,pCas9-miR167。使用酶解法分離紅麻葉片原生質(zhì)體,分別將構(gòu)建好的三個(gè)Cas9載體轉(zhuǎn)入紅麻葉片原生質(zhì)體中進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá),測序結(jié)果表明:pCas9-miR394,pCas9-miRn20在紅麻原生質(zhì)體中具有靶向切割活性。5.利用煙草的遺傳轉(zhuǎn)化體系,使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法將構(gòu)建好的miR394a、miRn20、miR167b過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草中進(jìn)行功能研究,通過分子檢測獲得一批miR394a、miRn20、miR167b轉(zhuǎn)基因植株。觀察這3類植株目前的表型,兩株miR394a轉(zhuǎn)基因苗表現(xiàn)為植株矮小,葉片小且厚實(shí),葉片顏色深綠,其它轉(zhuǎn)基因苗與野生型相比沒有明顯差異,營養(yǎng)生長均正常。
【學(xué)位單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S563.5
【部分圖文】：

３．１紅麻花藥基因組ＤＮＡ和ＲＮＡ的質(zhì)量檢測逡逑瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明提取的基因組ＤＮＡ純度高，無蛋白污染，經(jīng)紫外逡逑分光光度計(jì)檢測ＤＮＡ的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０為１．８１邋（圖３－ｌａ）；紅麻花藥總ＲＮＡ條逡逑帶清晰，完整性較好，基本沒有降解，無ＤＮＡ污染，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測逡逑ＵＧ９３Ａ邋和邋ＵＧ９３Ｂ邋的總邋ＲＮＡ邋的邋ＯＤ２６０／ＯＤ２８０邋分另ＩＪ為邋１．９３邋和邋１．９１邋（圖邋３－ｌｂ），逡逑可用于下一步的實(shí)驗(yàn)中。逡逑１２邋Ｍ逡逑■ｐ－逡逑圖３－１：紅麻核酸質(zhì)量檢測逡逑ａ．

邐３４３６９１４邐１５５６３７２８逡逑３．２．２�。遥危灵L度分布統(tǒng)計(jì)逡逑對兩個(gè)文庫中的Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ進(jìn)行小ＲＮＡ長度分布統(tǒng)計(jì)，從圖３－２可以看出逡逑這兩個(gè)�。遥危廖膸熘械男。遥危灵L度分布十分相似，文庫中的�。桑祝林饕植煎义显冢玻保浚玻矗睿舻姆秶�，其中最豐富的小ＲＮＡ為２４ｎｔ。這些結(jié)果與其它植物中報(bào)逡逑道的尺寸分布特征一致，如山核桃［９１］、蘆筍［９２］。逡逑７００００００逡逑６００００００邋－邐ｒ逡逑５００００００邋－逡逑＾邋４００００００邋－逡逑＾邋３００００００邋－Ｉ邐＿ＵＧ９３Ａ逡逑２００００００邋｜邐ｎ邋－邐ＤＵＧ９３Ｂ逡逑１００００００邐ｎ邋Ｊｌ｜邋，邋ＩＩ逡逑０邋Ｌ邋＾邋Ｍｌ．邋１１１．邋Ｉ…．ｌｌ邋ｌｌｉｌ邋ｌｌ邋ｉｌＭｌ逡逑１８邋１９邋２０邋２１邋２２邋２３邋２４邋２５邋２６邋２７邋２８邋２９邋３０逡逑ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｌｅｎｇｔｈ邋（ｎｔ）逡逑圖３－２：紅麻花藥ＵＧ９３Ａ和ＵＧ９３Ｂ文庫中�。遥危恋拈L度分布。逡逑Ｆｉｇ．邋３－２：邋Ｌｅｎｇｔｈ邋ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｓｍａｌｌ邋ＲＮＡｓ邋ｉｎ邋ｆｌｏｗｅｒ邋ｂｕｄｓ邋ｏｆ邋ＵＧ９３Ａ邋ａｎｄ邋ＵＧ９３Ｂ邋ｌｉｂｒａｒｉｅｓ邋ｏｆ逡逑Ｋｅｎａｆ．逡逑３．２．３邋ｓＲＮＡ分類注釋逡逑利用Ｂｏｗｔｉｅ軟件，把測序所得Ｃｌｅａｎ邋Ｒｅａｄｓ分別與ＧｔＲＮＡｄｂ數(shù)據(jù)庫、Ｓｉｌｖａ逡逑數(shù)據(jù)庫、Ｒｅｐｂａｓｅ數(shù)據(jù)庫以及Ｒｆａｍ數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，然后，把核內(nèi)�。遥危铃义希ǎ螅睿遥危粒⒑巳市″澹遥危粒ǎ螅睿铮遥危粒�、核糖體邋ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、轉(zhuǎn)運(yùn)邋ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）逡逑以及重復(fù)序列過濾掉

廣西大學(xué)頓士學(xué)位論文邐紅麻細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保詩系ｍｉ邋ｃｒｏＲＭ表達(dá)講及功研究逡逑續(xù)表３－４：ｍｉＲＮＡ序列邐長度逡逑ｍｉＲＮＡ邐Ｂ邐Ａ邋ＣＧ％邋ＭＦＥ邋ＭＦＥＩ逡逑ｍｉＲＮＡ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邐ｌｅｎｇｔｈ逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ３９邐ＧＧＧＴＴＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧ邐２０邐１邐０邐４４．１５邐－２６．４邐０．７８逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ４０邐ＧＧＡＧＴＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＧＡＡＡＧＡＴＴＴ邐２５邐１３４邐０邐３８．４１邐－５７．８邐１．００逡逑ｈｃａ－ｍｉＲｎ４ｌ邐ＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＴＧＧＡＴＣＴＣＣＴＡＡＧＣ邐２４邐５３邐１０６邐３６．９４邐－２８．５邐７．００逡逑注：Ａ和Ｂ：邋ｍｉＲＮＡ在紅麻ＵＧ９３Ａ和ＵＧ９３Ｂ花藥的�。遥危廖膸熘袦y序得到的ｒｅａｄｓ數(shù)；逡逑ＣＧ％：發(fā)夾序列Ｇ＋Ｃ堿基百分含量；ＭＦＥ：最小自由能；ＭＦＥＩ：最小折疊自由能系數(shù)。逡逑？邐ｓ邐？邐ｓ

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2819055