玉米是世界三大糧食作物之一,也是動(dòng)物飼料和工業(yè)生產(chǎn)的重要原料。在世界各地廣泛種植,年產(chǎn)量已經(jīng)超過(guò)水稻和小麥,成為第一大糧食作物。玉米種子的發(fā)育是影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。因此,種子發(fā)育關(guān)鍵基因的克隆和功能解析以及種子發(fā)育遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建,對(duì)了解玉米種子發(fā)育的分子機(jī)制具有重要的理論意義,為進(jìn)一步的分子育種提供重要的理論依據(jù)。植物線粒體擁有自己的基因組,保留其原核祖先大約5%的基因。這些基因主要編碼氧化磷酸化相關(guān)蛋白、核糖體蛋白、tRNA和rRNA。RNA的C→U編輯廣泛存在于線粒體和葉綠體的轉(zhuǎn)錄本中。其中,在多種植物中,線粒體轉(zhuǎn)錄本具有超過(guò)300個(gè)編輯位點(diǎn)。RNA編輯經(jīng)常恢復(fù)進(jìn)化保守的氨基酸、形成起始或終止密碼子、促進(jìn)內(nèi)含子的剪接和提高tRNA的加工效率等。因此,RNA編輯是細(xì)胞器(線粒體和葉綠體)基因轉(zhuǎn)錄后加工的一個(gè)重要過(guò)程。雖然,現(xiàn)在已經(jīng)鑒定到多個(gè)參與RNA編輯的因子,但是,這些因子是如何參與該過(guò)程的還不太清楚。PPR-DYW類蛋白質(zhì)是重要的RNA編輯因子,玉米中82個(gè)PPR-DYW蛋白。其中只有少數(shù)幾個(gè)蛋白(EMP5、EMP18和PPR2263)的功能被報(bào)道。因此,PPR-DYW類蛋白功能的研究對(duì)解析RNAC-→U編輯過(guò)程以及編輯復(fù)合體的組成具有重要意義。本論文中,我們從玉米UniformMu突變體庫(kù)中分離了一個(gè)空果皮突變體emp21-1。emp21-1雜合體自交的果穗分離大約1/4的空果皮籽粒。通過(guò)Mu-seq克隆到了 Emp21,Emp21編碼一個(gè)由11個(gè)典型PPR結(jié)構(gòu)域,E1、E2和DYW結(jié)構(gòu)域組成的PPR-DYW類蛋白。我們從UniformMu玉米突變體庫(kù)中獲得了該基因的--個(gè)等位突變體emp21-2。連鎖鑒定和等位突變分析確定,Emp21是導(dǎo)致emp21-1空果皮表型的突變基因。本論文通過(guò)表型觀察、蛋白亞細(xì)胞定位分析、突變體線粒體轉(zhuǎn)錄本中編輯位點(diǎn)檢測(cè)、線粒體復(fù)合物組裝和活性分析、Emp21與Emp5的遺傳關(guān)系分析以及EMP21和EMP5與ZmMORF8相互作用分析等,查明了 EMP21為一個(gè)特殊的PPR-DYW蛋白,廣泛參與玉米線粒體RNAC→U編輯過(guò)程,并與ZmMORF8以及EMP5其它編輯因子互作,在玉米籽粒發(fā)育中起關(guān)鍵作用。該研究促進(jìn)了對(duì)PPR-DYW蛋白在玉米胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育中功能的認(rèn)識(shí),對(duì)解析RNAC→U編輯的分子機(jī)制具有一定的理論意義。主要結(jié)果如下:1)EMP21的功能缺失嚴(yán)重抑制玉米的胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育。emp21-1和emp21-2雜合體的自交果穗分離出大約1/4的空果皮籽粒,顯示該突變體是核基因隱性突變。授粉后12 d的突變體籽粒明顯小于野生型,胚和胚乳都非常小,而野生型的胚胎基本發(fā)育出了所有器官原基。突變體的成熟種子呈現(xiàn)嚴(yán)重的干癟表型。石蠟切片證實(shí)emp21的胚胎發(fā)生和胚乳發(fā)育嚴(yán)重缺失。2)Emp21編碼一個(gè)線粒體定位的PPR-DYW蛋白。Emp21編碼一個(gè)典型的PPR-DYW蛋白,由1 1個(gè)PPR基序、一個(gè)E1、E2和DYW結(jié)構(gòu)域組成。其中DYW結(jié)構(gòu)域具有保守的CDAs-like核心氨基酸(HxE(x)nCxxC)序列。亞細(xì)胞定位分析顯示EMP21僅定位于線粒體。3)EMP21參與玉米線粒體轉(zhuǎn)錄本中81個(gè)位點(diǎn)C→U的編輯。利用STS-PCRseq的方法分析了野生型玉米線粒體35個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因的編輯位點(diǎn)。根據(jù)600 Mb的測(cè)序數(shù)據(jù),在玉米線粒體中共鑒定到了 493個(gè)C→U的編輯位點(diǎn)。隨后,我們用兩個(gè)獨(dú)立的方法(STS-PCRseq和RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖比對(duì))分析emp21中線粒體編輯位點(diǎn)與野生型的差異,結(jié)果顯示,在emp21-1 積 emp21-2 中,nad7-77、atp1-1292、atp8-437、mad3-275 和 rps4-870的編輯完全缺失,76個(gè)位點(diǎn)的編輯相對(duì)于野生型明顯降低,其中大部分編輯的缺失導(dǎo)致編碼氨基酸的變化。4)EMP21的功能缺失抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ和Ⅴ的組裝和活性。BN-PAGE和Western blotting實(shí)驗(yàn)分析顯示,emp21-1的線粒體復(fù)合物I的組裝和活性嚴(yán)重降低,超級(jí)復(fù)合物Ⅰ+Ⅲ2低于檢測(cè)水平。同樣的,FFo-ATPase全酶以及其亞復(fù)合體F'和F1的水解活性和組裝在emp21-1中都完全缺失。因此,Emp21的突變嚴(yán)重抑制了玉米線粒體復(fù)合物I和V的組裝和活性。5)rpl16-458位點(diǎn)大約30%的編輯需要EMP21和EMP5的共同參與。以前的報(bào)道發(fā)現(xiàn)EMP5參與線粒體轉(zhuǎn)錄本上10個(gè)位點(diǎn)的編輯,其中的6個(gè)位點(diǎn)(rpl16-458、nad9-190、nad9-356、cox3-245、cox3-257 和rps12-71)的編輯在emp21中也存在缺陷。進(jìn)一步分析顯示rpl16-458在emp21-1和emp5-4中分別被編輯80%和73%,而在emp21-1 emp5-4雙突變體中下降到35%。這證明rp116-458位點(diǎn)大約30%的編輯需要EMP21和EMP5的共同參與。6)線粒體某些位點(diǎn)的編輯可能涉及EMP21和EMP5與ZmMORF8的相互作用。擬南芥中,MORF/RIP蛋白負(fù)責(zé)線粒體和葉綠體轉(zhuǎn)錄本大部分編輯位點(diǎn)的編輯。玉米MORF蛋白的功能尚無(wú)研究。結(jié)果顯示,EMP21參與編輯的34個(gè)位點(diǎn)在擬南芥中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的編輯需要MORF8的功能。同時(shí),EMP5參與編輯的8個(gè)位點(diǎn)在擬南芥中對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的編輯也需要MORF8。酵母雙雜交和熒光雙分子互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)都顯示EMP21和EMP5都可以與ZmMORF8直接相互作用。因此,玉米線粒體中某些位點(diǎn)的編輯可能涉及EMP21和EMP5與ZmMORF8的相互作用。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S513
【部分圖文】：

隨著中央液泡的增大，細(xì)胞質(zhì)和游離核會(huì)分布于胚囊邊緣，形成胚乳囊。逡逑細(xì)胞化期是指游離核之間產(chǎn)生細(xì)胞壁，形成單核的胚乳細(xì)胞，直到胚乳細(xì)胞充逡逑滿整個(gè)胚乳囊的時(shí)期（圖２）。胚乳的細(xì)胞化又分為兩個(gè)時(shí)期，第一個(gè)是小泡化逡逑期（ａｌｖｅｏｌａｔｉｏｎ），在該時(shí)期，首先形成垂直于胚乳細(xì)胞壁的背向細(xì)胞壁，其包逡逑圍在頂層游離核的周圍。背向細(xì)胞壁朝向中央液泡生長(zhǎng)，而平行于中央液泡的逡逑一側(cè)保持開(kāi)放（圖２）邋（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａｌ．，２０１４）。當(dāng)這些小的隔室形成平周壁時(shí)，形逡逑成位于胚乳最外層的小的外圍細(xì)胞。緊接著垂直液泡的方向形成第２－４層次級(jí)逡逑的細(xì)胞。隨后進(jìn)入分區(qū)化期（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ），該時(shí)期朝向胚乳中心由外向內(nèi)逐層逡逑形成胚乳細(xì)胞，直到不同方向形成的細(xì)胞連接在一起。通常最后形成的細(xì)胞較逡逑大，隨后這些細(xì)胞再分隔形成小的胚乳細(xì)胞（圖２）邋（Ｌｅｒｏｕｘｅｔａｌ．，２０１４）。緊接逡逑著，胚乳發(fā)育進(jìn)入分化期（通常授粉后５邋ｄ開(kāi)始），在該時(shí)期，位于胚周圍的細(xì)逡逑胞分化為胚周細(xì)胞（ｅｍｂｒｙｏｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ

Ｂａｒｋａｎ和Ｓｍａｌｌ基于已有的發(fā)現(xiàn)提出了一個(gè)可能的工作模型：即ＰＰＲ蛋逡逑白與ＲＮＡ結(jié)合，重構(gòu)ＲＮＡ，暴露出核酸酶切割位點(diǎn)，同時(shí)可能招募核酸內(nèi)切逡逑酶對(duì)ＲＮＡ進(jìn)行切割，完成ＲＮＡ末端的加工（圖６）邋（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，邋２０１４）。逡逑ＰＰＲ逡逑ＰＰＲＷ＾ｓ－ｅｌｅｍｅｎｔ邐Ｃ／ｓ－ｅｌｅｒ＾ｍ逡逑圖６邋ＰＰＲ蛋白重構(gòu)ＲＮＡ結(jié)構(gòu)的模型（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，邋２０１４）。逡逑Ｆｉｇ邋６邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｏｆ邋ＲＮＡ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｒｅｍｏｄｅｌｅｄ邋ｂｙ邋ＰＰＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋（Ｂａｒｋａｎ邋ａｎｄ邋Ｓｍａｌｌ，逡逑２０１４）．逡逑２．３邋ＰＰＲ蛋白的生物學(xué)意義逡逑ＰＰＲ蛋白廣泛分布于植物中，并且不同物種之間存在高度一致性。例如進(jìn)逡逑化樹(shù)分析顯示，超過(guò)８０％的擬南芥ＰＰＲ蛋白在水稻中存在直系同源蛋白逡逑（Ｏ＇Ｔｏｏｌｅ邋ｅｔａｌ．，２００８），說(shuō)明ＰＰＲ蛋白在不同物種中進(jìn)化保守，很可能具有一致逡逑或相似的功能。通過(guò)對(duì)不同物種ＰＰＲ突變體研究發(fā)現(xiàn)，ＰＰＲ蛋白在植物多個(gè)生逡逑長(zhǎng)發(fā)育階段和環(huán)境適應(yīng)性方面具有至關(guān)重要的作用。其突變體呈現(xiàn)多種表型：逡逑光合作用缺失（通常呈現(xiàn)葉片白化）、葉片發(fā)育異常、植株矮小、胚胎和胚乳發(fā)逡逑育抑制呈現(xiàn)空果皮表型（ｅｍｐｔｙ邋ｐｅｒｉｃａｒｐ，ｅｍｐ）或者小籽粒表型（ｓｍａｌｌ邋ｋｅｒｎｅｌ，逡逑ｓｍｋ）或者種子發(fā)育缺陷（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｋｅｒｎｅｌ

我們從ＵｎｉｆｏｒｍＭｕ玉米突變體庫(kù)中獲得一個(gè)空果皮突變體（Ｓｅｔｔｌｅｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２００７）。子代果穗上大約１／４邋（野生型：空果皮＝８８３：２９６＝２．９８：１）的種子呈現(xiàn)明顯逡逑的空果皮（ｅｍｐｔｙｐｅｒｉｃａｒｐ，邋ｅｍｐ）表型（圖７Ａ）。進(jìn)一步，我們?nèi)⊥还肷襄义险５暮涂展さ淖蚜�，進(jìn)行種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有正常的籽粒都可萌發(fā)，逡逑植株正常生長(zhǎng)，并且大約２／３植株的果穗出現(xiàn)表型分離；而所有的空果皮籽粒逡逑均不能萌發(fā)，以上說(shuō)明，導(dǎo)致該表型的突變是核基因隱性突變，并且該突變會(huì)逡逑導(dǎo)致種子的敗育。逡逑進(jìn)一步的表型觀察發(fā)現(xiàn)，授粉后１２邋ｄ的突變體籽粒明顯小于野生型。突變逡逑體籽粒具有肉眼不可見(jiàn)的胚和非常小的透明胚乳（圖７Ｅ和７Ｆ）；而野生型籽粒逡逑具有明顯的胚和胚乳的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胚乳出現(xiàn)明顯的淀粉化（圖７Ｂ和７Ｃ）。成熟逡逑的籽粒，突變體出現(xiàn)嚴(yán)重皺縮，呈現(xiàn)透明的薄片狀，沒(méi)有明顯的胚和胚乳組織逡逑（圖７Ａ和７Ｇ）。因此，我們命名該突變體為ｅｍ／

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