丹參(Salvia miltiorrhiza),是唇形科鼠尾草屬的多年生直立草本植物,其根和莖均可入藥,在治療心、腦血管疾病方面具有重要療效。其主要的藥用活性成分為脂溶性的丹參酮和水溶性的丹酚酸。目前,由于傳統(tǒng)種植丹參品質(zhì)下降,導(dǎo)致市場上的丹參酮、丹酚酸供不應(yīng)求,使得丹參酮、丹酚酸合成通路與代謝工程的研究成為一個熱點。茉莉酸(JA)是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的植物激素,其已經(jīng)被證明能夠通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達,誘導(dǎo)植物次生代謝產(chǎn)物的積累,bHLH轉(zhuǎn)錄因子示JA信號途徑的重要成員之一。本研究首先從本地丹參轉(zhuǎn)錄組庫中篩選出131條bHLH基因,并根據(jù)MJYE誘導(dǎo)數(shù)據(jù)庫,選擇一條受MJ誘導(dǎo)最為明顯的bHLH轉(zhuǎn)錄因子,并將其命名為SmbHLH7。隨后構(gòu)建了植物過表達載體,利用農(nóng)桿菌C58C1介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化丹參無菌苗獲得丹參毛狀根,并進行進一步的生化與代謝分析,現(xiàn)階段取得的成果如下:(1)生物學(xué)信息學(xué)分析:發(fā)現(xiàn)SmbHLH7與芝麻中的MYC2具有較高的同源性,多重序列比對分析表明:SmbHLH7具有一個保守的MYC結(jié)構(gòu)域(N端)和一個HLH結(jié)構(gòu)域(C端)。熱圖分析表明:在MJ誘導(dǎo)下,SmbHLH7及丹參酮途徑關(guān)鍵酶基因SmDXS2,SmAACT,SmCPS1等的響應(yīng)模式一致性較高。(2)基因克隆:以丹參葉片cDNA為模版,設(shè)計引物擴增目的片段,得到一條ORF全長1290bp,共編碼429個氨基酸的基因序列。(3)組織表達譜分析:發(fā)現(xiàn)SmbHLH7在主根,須根,葉柄中表達量較低,莖中表達較高,在葉中表達最高。這與丹參酮途徑關(guān)鍵酶基因SmHMGS、SmHMGR、SmDXR等在組織表達部位上具有一致性。(4)誘導(dǎo)表達譜分析:經(jīng)不同的外源激素處理后,SmbHLH7的表達水平均有不同程度的上升。經(jīng)MJ誘導(dǎo)后,SmbHLH7的表達水平從0.5 h后開始迅速上升,在2h時其表達量達到最高點,是對照組處理的80倍,不僅如此,SmbHLH7受外源ABA、GA_3、ET的誘導(dǎo)效果都很顯著,但對SA的誘導(dǎo)響應(yīng)不明顯。(5)轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得:構(gòu)建了植物過表達載體pHB-SmbHLH7-YFP,同時通過遺傳轉(zhuǎn)化共獲得SmbHLH7過表達毛狀根株系10個,空載轉(zhuǎn)基因株系11個。(6)關(guān)鍵酶基因表達譜分析:測定了上述株系丹參酮和丹酚酸合成途徑中的關(guān)鍵酶基因表達水平。發(fā)現(xiàn)過表達SmbHLH7,能夠明顯上調(diào)丹參酮合成途徑基因SmHMGS、SmGGPPS1、SmCYP76AH1、SmKSL1,同時明顯下調(diào)丹酚酸合成途徑基因SmRAS1,SmCYP98A14,SmTAT1。(7)丹參酮和丹酚酸含量分析:發(fā)現(xiàn)SmbHLH7能夠上調(diào)丹參中丹參酮的含量(15號株系上升最為明顯:達到8.89mg/g,而對照組僅為2.17mg/g);同時抑制丹酚酸的產(chǎn)量。(8)酵母單雜實驗:結(jié)果表明SmbHLH7可以明顯與SmRAS1關(guān)鍵酶啟動子互作。(9)Dual-luciferase assays實驗表明SmbHLH7能夠直接抑制丹酚酸合成途徑基因SmRAS1與SmTAT1的表達。說明其可能直接參與丹參中丹酚酸的生物合成調(diào)控,并起到負調(diào)控的作用。(10)酵母雙雜實驗及Bi FC實驗:酵母雙雜及雙分子熒光互補實驗證明SmbHLH7可以明顯與丹參中SmJAZ3L發(fā)生互作。綜上所述,本論文克隆得到了一條丹參中的bHLH基因:SmbHLH7并闡述了SmbHLH7在丹參酮、丹酚酸及萜類代謝途徑中的功能,并初步揭示了其在丹參次生代謝產(chǎn)物合成調(diào)控中的作用及其調(diào)控機制。這對深入認識丹參酮/丹酚酸的合成調(diào)控機理具有重要作用,同時也為對整個丹參酮與丹酚酸合成調(diào)控通路的解析提供了一定的實驗依據(jù)。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2;S567.53
【部分圖文】：

圖 1-1. 4 種丹參酮單體的化學(xué)結(jié)構(gòu)（Cao et al., 2Fig 1-1 The chemical structure of 4 tanshinone mon的得到這些丹參酮類化合物之初，科學(xué)家們便開始了人們對于它們作用的最初認識是從其抗菌活性開始的菌實驗發(fā)現(xiàn)：丹參的乙醚提取物總丹參酮對金黃色葡很好的抑菌作用，（高玉桂等，1979）。此外，中國表明：總丹參酮對溶血性鏈球菌及人型結(jié)核桿菌也有2005）。隨著人們對丹參酮研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了藥理活性。主要包括：1. 抗腫瘤作用：丹參酮類物其發(fā)揮抗腫瘤作用進而殺傷腫瘤細胞的基礎(chǔ)。同時，丹參酮 IIA 能夠體外誘導(dǎo)人宮頸癌細胞株 ME180 的趨于良性分化，繼而抑制腫瘤細胞的增殖及相關(guān)癌基明：丹參酮 IIA 能夠誘導(dǎo)白血病 HL-60 細胞凋亡，使

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文 文獻綜述后，DXP 在 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原酶（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase, DXR）作用下生成 2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸（2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP）（Takahashi et al., 1998），這是 DXP 途徑中第

7圖 1-3. 丹酚酸生物合成通路Fig 1-3 The salvianolic acid biosynthesis pathway1.3 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子1.3.1 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子概述植物在長期的生長和進化過程中：為了適應(yīng)外界環(huán)境的變化以及抵御各種生物及非生物脅迫，植物體內(nèi)形成了一系列復(fù)雜而高效的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。而對基因轉(zhuǎn)錄

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本文編號：2813876