【摘要】：甘蔗是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,我國(guó)是世界上第四大食糖生產(chǎn)國(guó)。甘蔗生長(zhǎng)于熱帶及亞熱帶地區(qū),適應(yīng)溫暖的氣候條件,低溫不僅限制了其地理分布,還會(huì)降低甘蔗產(chǎn)量和蔗糖分,是甘蔗生產(chǎn)區(qū)主要的氣候?yàn)?zāi)害之一。因此,培育抗寒性強(qiáng)的品種對(duì)甘蔗生產(chǎn)具有重要意義。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為甘蔗抗寒性的提高提供了有效的方法。本研究以轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗T1代及對(duì)照(WT)植株為試驗(yàn)材料,采用人工氣候室對(duì)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2、L3和L4)及對(duì)照進(jìn)行4℃低溫脅迫,旨在測(cè)定各甘蔗株系在低溫脅迫下SoTUA基因和SoTUA蛋白的表達(dá)量以及生理生化表現(xiàn);同時(shí)采用溫室大棚種植的方法,測(cè)定轉(zhuǎn)基因株系(L5、L6、L7、L8、L9、L10和L11)及對(duì)照株系在苗期、分蘗期、伸長(zhǎng)期和工藝成熟期的農(nóng)藝性狀。主要研究結(jié)果如下:(1)利用PCR技術(shù)對(duì)載體上的標(biāo)記基因GFP進(jìn)行擴(kuò)增,得到與陽性對(duì)照一致的條帶,并進(jìn)行GFP基因測(cè)序,表明得到了轉(zhuǎn)SoTUA基因T1代陽性植株。(2)將4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2、L3和L4)和對(duì)照進(jìn)行4℃低溫處理,利用qRT-PCR測(cè)定低溫脅迫下不同株系的SoTUA基因表達(dá)量,結(jié)果表明:在低溫處理前,SoTUA基因在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量高于對(duì)照組;所有株系在處理后被強(qiáng)烈誘導(dǎo),除L1外,其他株系均在2d時(shí)基因表達(dá)量達(dá)到最高值,總體上基因表達(dá)變化模式為先上升后下降再上升;低溫處理中轉(zhuǎn)基因甘蔗株系中SoTUA基因的表達(dá)量普遍高于對(duì)照。利用Western blot技術(shù)測(cè)定低溫脅迫下SoTUA蛋白的表達(dá)量,結(jié)果表明:在處理前各轉(zhuǎn)基因株系的SoTUA蛋白表達(dá)量均高于對(duì)照組;除L1外,其他株系均在低溫處理0-2 d時(shí)下調(diào),表達(dá)模式上存在差異,L1先升高再降低,L2和L4先降低再升高,L3緩慢降低,而CK以“降低-升高-降低-升高”的模式變化;低溫處理中轉(zhuǎn)基因甘蔗株系中SoTUA蛋白的表達(dá)量普遍高于對(duì)照。(3)在低溫脅迫下,4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的可溶性糖和可溶性蛋白含量普遍高于對(duì)照組,各株系可溶性糖含量以不同模式變化;可溶性蛋白在低溫處理前期強(qiáng)烈上調(diào)以響應(yīng)低溫,總體變化趨勢(shì)為先升高后降低;脯氨酸含量總體上呈“S”型模式變化,除L4外,其他轉(zhuǎn)基因株系均高于對(duì)照;各株系丙二醛含量均有上升,其中對(duì)照組的增幅最大;POD活性總體上呈先降低后升高再下降的模式變化,除L2外,其他株系與對(duì)照無明顯差異。分別利用改進(jìn)的極點(diǎn)排序法和隸屬函數(shù)法對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照進(jìn)行抗寒性評(píng)價(jià),結(jié)果表明4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系抗寒性均強(qiáng)于對(duì)照。(4)農(nóng)藝性狀的調(diào)查的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系L5、L6和L11在四個(gè)時(shí)期株高均高于對(duì)照;株系L5、L6、L8和L11在四個(gè)時(shí)期莖徑均高于對(duì)照(其中L6在四個(gè)時(shí)期均顯著高于對(duì)照);在四個(gè)時(shí)期中,除L6和L7外,其他5個(gè)株系的葉綠素含量均高于對(duì)照。株系L5、L8和L9在四個(gè)時(shí)期中葉面積大小均高于對(duì)照。除株系L6和L9外,其余株系在株高、莖徑、葉面積和葉綠素含量上顯著高于對(duì)照或等效于對(duì)照,說明轉(zhuǎn)免SoTUA基因并沒有使甘蔗植株的農(nóng)藝性狀產(chǎn)生不良效果。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S566.1
【圖文】：

總ＤＮＡ提取后，用微量分光光度計(jì)Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ測(cè)定ＤＮＡ濃逡逑度與Ａ２６０／Ａ２８０值，ＤＮＡ濃度在１５０邋ｎｇ／｜止左右，Ａ２６０／Ａ２８０值為丨．８邋ＡＷ，ＤＮＡ純逡逑度較高；然后用１％的凝膠電泳檢測(cè)ＤＮＡ條帶，部分結(jié)果如圖３－１所示。從圖３－１屮可逡逑看出ＤＮＡ條帶清晰明亮，說明ＤＮＡ質(zhì)量較好，可用于下一步檢測(cè)。逡逑“Ｂｍ逡逑圖３－１轉(zhuǎn)基因甘蔗總ＤＮＡ電泳檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ＤＮＡ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋１４：轉(zhuǎn)基因甘蔗株系（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３邋和邋Ｌ４）；邋５：邋ＣＫ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ｌｉｎｅｓ邋（ＬＩ，邋Ｌ２，邋Ｌ３邋ａｎｄ邋Ｌ４）邋；邋５：邋ＣＫ逡逑３．１．２轉(zhuǎn)基因甘蔗ＰＣＲ檢測(cè)逡逑轉(zhuǎn)基因甘蔗的ＰＣＲ檢測(cè)部分結(jié)果如圖３－２所示，陽性對(duì)照及部分甘蔗樣品在７００邋ｂｐ逡逑處條帶一致，出現(xiàn)雙條帶可能是由于引物不特異所致，陰性對(duì)照與Ｈ２０均無條帶。將逡逑７００邋ｂｐ處條帶進(jìn)行切割，使用膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物后測(cè)序，測(cè)丨及明ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增產(chǎn)物為ＧＦＰ基因

總ＲＮＡ提取后，用微量分光光度計(jì)Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ測(cè)定ＲＮＡ濃逡逑度與Ａ２６０／Ａ２８０值，濃度在５００邋ｎｇ／卩Ｌ左右，Ａ２６０／Ａ２８０值在２．０左右，純度高，然后逡逑用１％的凝膠電泳檢測(cè)ＲＮＡ條帶，部分結(jié)果如圖３－３所示，２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶明亮整齊，逡逑５Ｓ也可見

利用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ邋（ＲｏＣｈｅ）邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)后可逡逑得到溶解曲線，以此判斷引物是否可行，好的溶解曲線應(yīng)呈單峰，沒有非特異性擴(kuò)增。逡逑由圖３－４可見，引物ａ并沒有得到好的溶解曲線，說明該引物無法用于ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑試驗(yàn)，而引物義ＨＸ４邋ｂ和Ｃ＾ＰＤ／／引物得到單一峰且無非特異性擴(kuò)增，說明引物特異性逡逑好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。逡逑２４逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號(hào)：2796619