【摘要】：甘蔗是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,我國是世界上第四大食糖生產(chǎn)國。甘蔗生長于熱帶及亞熱帶地區(qū),適應(yīng)溫暖的氣候條件,低溫不僅限制了其地理分布,還會降低甘蔗產(chǎn)量和蔗糖分,是甘蔗生產(chǎn)區(qū)主要的氣候災(zāi)害之一。因此,培育抗寒性強(qiáng)的品種對甘蔗生產(chǎn)具有重要意義。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為甘蔗抗寒性的提高提供了有效的方法。本研究以轉(zhuǎn)SoTUA基因甘蔗T1代及對照(WT)植株為試驗材料,采用人工氣候室對轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2、L3和L4)及對照進(jìn)行4℃低溫脅迫,旨在測定各甘蔗株系在低溫脅迫下SoTUA基因和SoTUA蛋白的表達(dá)量以及生理生化表現(xiàn);同時采用溫室大棚種植的方法,測定轉(zhuǎn)基因株系(L5、L6、L7、L8、L9、L10和L11)及對照株系在苗期、分蘗期、伸長期和工藝成熟期的農(nóng)藝性狀。主要研究結(jié)果如下:(1)利用PCR技術(shù)對載體上的標(biāo)記基因GFP進(jìn)行擴(kuò)增,得到與陽性對照一致的條帶,并進(jìn)行GFP基因測序,表明得到了轉(zhuǎn)SoTUA基因T1代陽性植株。(2)將4個轉(zhuǎn)基因株系(L1、L2、L3和L4)和對照進(jìn)行4℃低溫處理,利用qRT-PCR測定低溫脅迫下不同株系的SoTUA基因表達(dá)量,結(jié)果表明:在低溫處理前,SoTUA基因在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量高于對照組;所有株系在處理后被強(qiáng)烈誘導(dǎo),除L1外,其他株系均在2d時基因表達(dá)量達(dá)到最高值,總體上基因表達(dá)變化模式為先上升后下降再上升;低溫處理中轉(zhuǎn)基因甘蔗株系中SoTUA基因的表達(dá)量普遍高于對照。利用Western blot技術(shù)測定低溫脅迫下SoTUA蛋白的表達(dá)量,結(jié)果表明:在處理前各轉(zhuǎn)基因株系的SoTUA蛋白表達(dá)量均高于對照組;除L1外,其他株系均在低溫處理0-2 d時下調(diào),表達(dá)模式上存在差異,L1先升高再降低,L2和L4先降低再升高,L3緩慢降低,而CK以“降低-升高-降低-升高”的模式變化;低溫處理中轉(zhuǎn)基因甘蔗株系中SoTUA蛋白的表達(dá)量普遍高于對照。(3)在低溫脅迫下,4個轉(zhuǎn)基因株系的可溶性糖和可溶性蛋白含量普遍高于對照組,各株系可溶性糖含量以不同模式變化;可溶性蛋白在低溫處理前期強(qiáng)烈上調(diào)以響應(yīng)低溫,總體變化趨勢為先升高后降低;脯氨酸含量總體上呈“S”型模式變化,除L4外,其他轉(zhuǎn)基因株系均高于對照;各株系丙二醛含量均有上升,其中對照組的增幅最大;POD活性總體上呈先降低后升高再下降的模式變化,除L2外,其他株系與對照無明顯差異。分別利用改進(jìn)的極點排序法和隸屬函數(shù)法對轉(zhuǎn)基因株系及對照進(jìn)行抗寒性評價,結(jié)果表明4個轉(zhuǎn)基因株系抗寒性均強(qiáng)于對照。(4)農(nóng)藝性狀的調(diào)查的結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系L5、L6和L11在四個時期株高均高于對照;株系L5、L6、L8和L11在四個時期莖徑均高于對照(其中L6在四個時期均顯著高于對照);在四個時期中,除L6和L7外,其他5個株系的葉綠素含量均高于對照。株系L5、L8和L9在四個時期中葉面積大小均高于對照。除株系L6和L9外,其余株系在株高、莖徑、葉面積和葉綠素含量上顯著高于對照或等效于對照,說明轉(zhuǎn)免SoTUA基因并沒有使甘蔗植株的農(nóng)藝性狀產(chǎn)生不良效果。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S566.1
【圖文】：

總ＤＮＡ提取后，用微量分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ測定ＤＮＡ濃逡逑度與Ａ２６０／Ａ２８０值，ＤＮＡ濃度在１５０邋ｎｇ／｜止左右，Ａ２６０／Ａ２８０值為丨．８邋ＡＷ，ＤＮＡ純逡逑度較高；然后用１％的凝膠電泳檢測ＤＮＡ條帶，部分結(jié)果如圖３－１所示。從圖３－１屮可逡逑看出ＤＮＡ條帶清晰明亮，說明ＤＮＡ質(zhì)量較好，可用于下一步檢測。逡逑“Ｂｍ逡逑圖３－１轉(zhuǎn)基因甘蔗總ＤＮＡ電泳檢測逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ａｇａｒｏｓｅ邋ｇｅｌ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ＤＮＡ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；邋１４：轉(zhuǎn)基因甘蔗株系（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３邋和邋Ｌ４）；邋５：邋ＣＫ逡逑Ｍ：邋ＤＬ２０００邋ｍａｒｋｅｒ；邋１－４：邋Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｓｕｇａｒｃａｎｅ邋ｌｉｎｅｓ邋（ＬＩ，邋Ｌ２，邋Ｌ３邋ａｎｄ邋Ｌ４）邋；邋５：邋ＣＫ逡逑３．１．２轉(zhuǎn)基因甘蔗ＰＣＲ檢測逡逑轉(zhuǎn)基因甘蔗的ＰＣＲ檢測部分結(jié)果如圖３－２所示，陽性對照及部分甘蔗樣品在７００邋ｂｐ逡逑處條帶一致，出現(xiàn)雙條帶可能是由于引物不特異所致，陰性對照與Ｈ２０均無條帶。將逡逑７００邋ｂｐ處條帶進(jìn)行切割，使用膠回收試劑盒回收ＰＣＲ產(chǎn)物后測序，測丨及明ＰＣＲ逡逑擴(kuò)增產(chǎn)物為ＧＦＰ基因

總ＲＮＡ提取后，用微量分光光度計Ｔｈｅｒｍｏ邋Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ邋ＮａｎｏＤｒｏｐ邋２０００ｃ測定ＲＮＡ濃逡逑度與Ａ２６０／Ａ２８０值，濃度在５００邋ｎｇ／卩Ｌ左右，Ａ２６０／Ａ２８０值在２．０左右，純度高，然后逡逑用１％的凝膠電泳檢測ＲＮＡ條帶，部分結(jié)果如圖３－３所示，２８Ｓ和１８Ｓ兩條帶明亮整齊，逡逑５Ｓ也可見

利用ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ＩＩ邋（ＲｏＣｈｅ）邋ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ儀進(jìn)行實時熒光定量ＰＣＲ反應(yīng)后可逡逑得到溶解曲線，以此判斷引物是否可行，好的溶解曲線應(yīng)呈單峰，沒有非特異性擴(kuò)增。逡逑由圖３－４可見，引物ａ并沒有得到好的溶解曲線，說明該引物無法用于ｑＲＴ－ＰＣＲ逡逑試驗，而引物義ＨＸ４邋ｂ和Ｃ＾ＰＤ／／引物得到單一峰且無非特異性擴(kuò)增，說明引物特異性逡逑好，可用于后續(xù)試驗。逡逑２４逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 葉頡;闕友雄;許莉萍;;中國轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化的現(xiàn)實條件與策略分析[J];科技管理研究;2015年12期

2 饒國棟;睢金凱;張建國;;毛白楊α-微管蛋白基因家族的克隆與序列分析[J];林業(yè)科學(xué)研究;2015年01期

3 李楊瑞;楊麗濤;譚宏偉;朱秋珍;王維贊;楊柳;;廣西甘蔗栽培技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年10期

4 滕崢;李鳴;崔永禎;方位寬;梁朝旭;何姍珊;梁俊;吳凱朝;葉燕萍;李容柏;;農(nóng)桿菌介導(dǎo)冷調(diào)節(jié)基因(Cbcor15a)遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗體系的建立[J];南方農(nóng)業(yè)學(xué)報;2014年08期

5 姜麗娜;張黛靜;宋飛;劉佩;樊婷婷;余海波;李春喜;;不同品種小麥葉片對拔節(jié)期低溫的生理響應(yīng)及抗寒性評價[J];生態(tài)學(xué)報;2014年15期

6 馮勛偉;才宏偉;;結(jié)縷草CBF基因的同源克隆及其轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗寒性驗證[J];作物學(xué)報;2014年09期

7 饒國棟;張建國;;植物微管蛋白基因研究進(jìn)展[J];世界林業(yè)研究;2013年03期

8 花慶;劉小剛;張靜雅;田豐;孫得壬;郭藹光;徐虹;;小麥冷馴化相關(guān)基因及抗寒性分子機(jī)理研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2012年36期

9 唐仕云;楊麗濤;李楊瑞;;不同甘蔗基因型對低溫脅迫的響應(yīng)及其耐寒性評價[J];熱帶作物學(xué)報;2012年04期

10 孫玉潔;王國槐;;外源生長調(diào)節(jié)劑對植物抗寒性的影響[J];作物研究;2011年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 孫波;低溫脅迫對甘蔗幼苗根系生長代謝的影響和相關(guān)基因α-tubulin的功能研究[D];廣西大學(xué);2016年

2 張保青;低溫脅迫下甘蔗后期生理特性及差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];廣西大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前5條

1 王露蓉;轉(zhuǎn)SoSUT5基因甘蔗T_1代的功能驗證及生理生化特性分析[D];廣西大學(xué);2018年

2 張云;華南忍冬ARF1、TUA3以及AP4-μ基因克隆與功能驗證[D];華中科技大學(xué);2015年

3 譚秦亮;甘蔗SoNCED和SoSnRK2.1基因的原核表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化研究[D];廣西大學(xué);2013年

4 沈林波;紫花苜蓿防御基因MsDefl轉(zhuǎn)化甘蔗及抗病轉(zhuǎn)基因植株的篩選[D];海南大學(xué);2012年

5 黃桂英;真姬菇低溫脅迫下菌絲體酶活變化及差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

本文編號：2796619