【摘要】：一氧化氮(Nitric oxide,NO)作為植物體內(nèi)的信號分子,在植物的抗逆響應中扮演者重要的角色。紫花苜蓿(Medicago sativa)是一類多年生優(yōu)質豆科牧草,在各類人工草地栽培中具有重要地位,但干旱一直是制約紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的主要因素之一,因此不斷深入紫花苜蓿幼苗的抗旱性研究,對紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有決定性作用。本研究以紫花苜蓿為試驗材料,采用盆栽試驗方法,用聚乙二醇(PEG-6000)作為滲透介質模擬干旱脅迫,外源噴施NO供體SNP(硝普鈉),NO抑制劑cPTIO(carboxy-PTIO),采用生理生化和small RNA測序分析方法,分析干旱脅迫中NO作用下紫花苜蓿幼苗苯丙烷類代謝中非結構碳水化合物含量、酚類物質含量和相關酶活性的動態(tài)變化以及miRNA調(diào)控的變化,探究外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿幼苗苯丙烷類代謝及miRNA調(diào)控的影響。取得如下研究結果:(1)研究了外源NO對干旱脅迫下紫花苜蓿葉片及根系中苯丙烷類代謝前體物質非結構性碳水化合物及代謝關鍵酶的影響,結果顯示外源NO促進了紫花苜蓿葉片中淀粉的分解、根系中淀粉的積累,提高葉片及根系中可溶性糖(蔗糖、果糖和葡萄糖)含量,降低了滲透勢,促進細胞吸水,緩解干旱造成的損傷。此外,外源NO能提高干旱脅迫下紫花苜蓿葉片中SS、AI和NI活性,降低了SPS活性,提高根系中SS、SPS和轉化酶活性,使蔗糖的合成與分解處于高水平的動態(tài)平衡,增強了紫花苜蓿的抗旱性。而NO清除劑cPTIO則會不同程度的抑制紫花苜蓿幼苗中NSC及其相關酶活性。(2)外源NO影響干旱脅迫下紫花苜蓿葉片及根系中苯丙烷類代謝中酚類物質的代謝及分配,具體表現(xiàn)為干旱脅迫下外源NO提高了紫花苜蓿葉片及根系中總酚,類黃酮和木質素的含量,葉片及根系木質素的含量呈先升高后降低的變化趨勢,分別比單獨干旱脅迫提高了7.52%和17.66%,并且根系中木質素的含量要高于葉片,對外源NO更加敏感。外源NO作用下紫花苜蓿葉片中花青素含量比單獨干旱脅迫提高了13.53%。此外,外源NO提高了干旱脅迫下紫花苜蓿中PAL和PPO的活性,其可使木質素和類黃酮在處理后期仍保持較高的代謝水平。干旱脅迫下NO抑制劑cPTIO則會不同程度的影響紫花苜蓿幼苗中總酚,類黃酮,木質素和花青素的合成及其代謝關鍵酶的活性,說明內(nèi)源NO參與到了酚類物質的代謝中。(3)外源NO調(diào)控紫花苜蓿miRNA對干旱脅迫做出響應,使用small RNA測序技術鑒定了紫花苜蓿中177個新miRNAs和屬于46家族的90個已知miRNAs。在PEG樣本中鑒定了32個差異表達的miRNAs,為紫花苜蓿中響應干旱的miRNAs做了進一步的補充,在PEG+SNP樣本鑒定了55個差異表達的miRNAs。此外,對差異表達的miRNA進行了靶基因預測,在PEG和PEG+SNP樣本中分別有86和157個潛在靶基因。GO富集分析和KEGG途徑分析顯示紫花苜蓿中許多與植物脅迫耐受性相關的生物學過程得到富集。外源NO可以啟動更多的生物學過程及細胞組分去應對干旱脅迫,外源NO在干旱脅迫下苯丙烷類代謝中發(fā)揮重要作用,干旱脅迫下,miR5214-3p,miR5752a,miR2118,miR399a和miR156g-5p調(diào)控糖質子轉運體,淀粉酶活性,過氧化物酶體,蛋白質水解酶以及核糖體參與到苯丙烷類代謝前體物質NSC的代謝中響應外源NO。此外,外源NO調(diào)控miR156g-5p,miR5561-3p和miR156a的靶基因谷胱甘肽轉移酶及SPL基因參與到酚類物質的代謝中應對干旱脅迫。qRT-PCR定量結果證實miRNA譜和測序結果一致,并與其靶基因表現(xiàn)出相反的表達模式。
【學位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S541.9
【圖文】：

甘肅農(nóng)業(yè)大學 2019 屆碩士學位論文差異表達。如圖 4-4b 所示，14（7 個上調(diào)，7 個下調(diào)）個差異表達的 miRNA 在 PEGEG+SNP 樣品中均被鑒定到。顯而易見的是 PEG+SNP 樣本中差異表達的新 miRNA 要EG 樣品中多。由此可見，外源 NO 可以誘導更多新 miRNA 出現(xiàn)�？傊@些新 miR助于闡明干旱脅迫下的干旱響應和外源 NO 響應 miRNA 的調(diào)控機制。a b

圖 4-3 紫花苜蓿差異表達保守 miRNA 的熱圖Fig.4-3 Heatmap of differentially-expressed conservedmiRNAs in alfalfa 樣本中差異表達保守 miRNA 熱圖 b：PEG + SNP 樣本中差異表達保守 miRNA 熱圖tmap from differentially-expressedconserved miRNA in PEG samples b: Heatmap from differentially-expressed conserved miRNsamples.

甘肅農(nóng)業(yè)大學 2019 屆碩士學位論文miR399a 和 miR156g-5p 調(diào)控糖質子轉運體，淀粉酶活性，過氧化物酶體，蛋白質水解酶以及核糖體參與到苯丙烷類代謝前體物質 NSC 的代謝中響應外源 NO。此外，外源 NO 調(diào)控miR156g-5p，miR5561-3p 和 miR156a 的靶基因谷胱甘肽轉移酶及 SPL 基因參與到苯丙烷類代謝酚類物質的代謝中響應干旱脅迫。據(jù)我們所知，我們是首次關注干旱脅迫下外源 NO調(diào)控植物抗旱 miRNA 作用機制的研究，該研究將為理解外源 NO 的作用機理及其應用推廣奠定基礎。因此建議在干旱地區(qū)種植和培育紫花苜蓿幼苗的過程中，可以考慮通過外源噴施 0.1 mmol/L NO 增強紫花苜蓿幼苗的適應能力，減輕干旱脅迫對紫花苜蓿產(chǎn)量和質量損害。靶基因分子功能miRNA代謝過程

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