【摘要】：TILLING技術(shù)是一種通過使用化學(xué)誘變劑EMS進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)生點突變,并通過高通量篩選技術(shù)進(jìn)行突變位點掃描來研究基因功能的反向遺傳學(xué)技術(shù)。該技術(shù)從分子水平上建立突變體規(guī)�；Y選的技術(shù)平臺,為研究植物體基因的功能提供了新的方向。本研究在實驗室前期工作的基礎(chǔ)上,對小麥TaCKX1基因未測序部分進(jìn)行了序列補(bǔ)充,完善了小麥品種濟(jì)麥22 EMS誘變TILLING群體,建立并優(yōu)化了基于HRM技術(shù)的突變體檢測體系,并對目標(biāo)基因TaCKX1進(jìn)行了突變體的篩選。主要結(jié)果如下:1.小麥TaCKX1基因序列的補(bǔ)充測序為了更好地研究小麥TaCKX1基因,獲得該基因A、B、D三個部分同源基因的全部基因組信息,本研究通過參考NCBI中現(xiàn)有小麥TaCKX1基因序列以及水稻、玉米等相近物種CKX1基因序列信息,使用Primer 5軟件設(shè)計TaCKX1-B亞組前段、TaCKX1-D全段的測序引物,以小麥栽培品種濟(jì)麥22號基因組DNA為模板,對本實驗室前期未完成測序的亞基因組繼續(xù)進(jìn)行克隆。測序結(jié)果經(jīng)序列比對后,確定所測序列為小麥TaCKX1基因未測序列,該結(jié)果為本研究后續(xù)對該基因的探索奠定了基礎(chǔ)。2.HRM突變體篩選體系的建立與優(yōu)化基于實驗室自制的Q-PCR體系,通過改變其中不飽和熒光染料SYBR Green I為飽和熒光染料為Eva Green,并調(diào)整體系中的染料濃度、Mg~(2+)終濃度、引物終濃度及模板用量四個方面,對該體系進(jìn)行優(yōu)化試驗,以建立HRM突變體篩選體系。通過構(gòu)建僅含一個堿基差異的四個單堿基差異載體為HRM體系優(yōu)化的模板,優(yōu)化HRM反應(yīng)體系中各組分濃度,以達(dá)到建立的HRM體系能夠區(qū)分單堿基突變的目標(biāo)。經(jīng)試驗優(yōu)化體系后,確定當(dāng)反應(yīng)體系中染料添加量為0.1875μL,Mg~(2+)濃度為4.5 mmol/L,模板量為100~200 ng,引物終濃度為5μmol時,本體系能夠區(qū)分單堿基差異,對SNP進(jìn)行分型,達(dá)到預(yù)期篩選單堿基突變篩選目標(biāo)的要求。3.小麥突變體掃描檢測技術(shù)平臺的建立為了建立基于HRM技術(shù)的小麥TILLING庫的篩選,本實驗室前期對與籽粒大小和產(chǎn)量相關(guān)的小麥TaCKX1基因進(jìn)行了序列信息的確定。但是,由于HRM技術(shù)對篩選引物的特異性要求很高,所以需要對小麥TaCKX1基因三個部分同源亞組基因信息進(jìn)行進(jìn)一步的校正。通過再次設(shè)計特異性引物,對該基因的三個亞組進(jìn)行了重測序,校正了之前測序存在的差異位點。本研究利用校正后的TaCKX1基因序列,設(shè)計篩選了三個亞組共計51對引物,對其中可以特異擴(kuò)增出單一明亮條帶且無引物二聚體的引物進(jìn)行進(jìn)一步的HRM反應(yīng)。通過對606份EMS誘導(dǎo)的突變體植株基因組DNA的兩輪PCR擴(kuò)增及HRM分析,在TaCKX1基因三個亞組中進(jìn)行分亞組的突變體篩選,并成功篩選到了由G堿基到A堿基的突變。通過對TaCKX1基因的部分外顯子區(qū)域進(jìn)行突變體的預(yù)篩選,驗證了該平臺的運(yùn)行狀況,現(xiàn)已初步建立可以對任意目標(biāo)基因的突變體進(jìn)行掃描檢測的技術(shù)平臺。
【學(xué)位授予單位】：煙臺大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S512.1
【圖文】：

1 文獻(xiàn)綜述突變，如缺失、插入或替換，并對其進(jìn)行切割。Yang 等[35]通過純化 CEL I 酶的粗體物、優(yōu)化酶切體系后發(fā)現(xiàn)，當(dāng) pH 值為中性時酶切反應(yīng)效果最佳，且當(dāng)反應(yīng)體系中Mg2+和 Zn2+濃度適宜時，酶切反應(yīng)能夠?qū)?SNP 位點進(jìn)行切割，這不僅降低了TILLING 突變體庫篩選的成本，還有效提升了篩選的效率。近年來，發(fā)展起來一種基于熔解曲線的篩選方法，相對于酶切法篩選突變體時需要進(jìn)行后續(xù)的 DPAGE 檢測，這種方法就簡單很多。高分辨率熔解曲線法（HRM），基于普通的 PCR 反應(yīng)，實時監(jiān)測雙鏈 DNA 與飽和熒光染料的結(jié)合情況，區(qū)分單個堿基的差異，是一種新型核酸研究方法。該方法操作簡便，速度快、通量高，不受突變堿基位置和類型的局限，無需測序即可確定突變位點的存在[36,37]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品和中藥材鑒定等領(lǐng)域。1.2.2 TILLING 技術(shù)的方法流程

圖 2-1 小麥 TaCKX1 三個部分同源基因的結(jié)構(gòu)[91]Fig 2-1 The three homologous gene structure of wheat TaCKX1[91]表 2-2 用于擴(kuò)增 TaCKX1 基因的 PCR 引物Table 2-2 PCR primers for TaCKX1 gene amplification引物名稱Primers name引物序列（5’-3’）Primer sequence (5’-3’)位置和退火溫度WC1F0b GCTTTCACCGTAGCAGCATCTCAGAG nr2，62.5℃WC1F2b CGGGGGTGCAACTGCCAAGAG nr83，62℃WC1R2b CTCCTGGTCGGCGGAAAAGGTG nr1436，61.7℃WC1F0d TCACCGCCGTAGCAGCATCTTG nr3，61.5℃WC1F3a GATCATCATCATCACATTAACGCGCCTAG nr142，61.6℃WC1R12d CCCAGCGCCGCATCGAACAG nr1248，62.5℃

當(dāng)條帶中有與目標(biāo)產(chǎn)物一致的帶時，對該產(chǎn)物分析度、濃度及質(zhì)量檢測 法提取野生型濟(jì)麥 22 號基因組 DNA 后，使用超微量度的檢測。經(jīng)檢測，5 個基因組 DNA 樣品的 A260/AA260/A230 比值均在 2.0~2.4 之間，說明提取的 DNA樣品的濃度均在 2000~5000 ng/μL，濃度較高，符合后檢測結(jié)果如圖 2-2 所示，DNA 有單條主帶，且主帶下完整、無斷裂或降解。M 1 2 3 4 5

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1 沈文俊;小麥TILLIING突變體庫中CKX1基因突變體篩選體系的建立與優(yōu)化[D];煙臺大學(xué);2019年

本文編號：2774211