【摘要】：水稻是嚴(yán)格自花授粉作物。水稻穎花開放是由漿片吸水膨脹啟動的,漿片膨脹時向外推擠內(nèi)稃和外稃,從而撐開內(nèi)稃和外稃之間的鉤合使得穎殼張開,同時花絲伸長、花藥伸出穎殼并開裂,花粉散落,柱頭也伸出穎殼以便授粉。水稻開穎是極其復(fù)雜且受許多基因精確調(diào)控的過程,并且容易受環(huán)境因素的影響,比如光、溫度等。水稻穎花的適時開放和閉合對于水稻的產(chǎn)量,雜交水稻制種至關(guān)重要。前人的研究表明茉莉酸、可溶性糖、無機(jī)離子運動、二氧化碳積累等生理生化過程參與了水稻開穎過程,然而這些過程背后的分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)制的研究卻幾乎空白。究其原因主要是缺乏合適的閉穎突變體。水稻花期特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OsbZIPX,其T-DNA插入突變體bzipx表現(xiàn)為閉穎自花授粉,但是其生長結(jié)實并未受顯著影響,該突變體是研究水稻閉穎的分子機(jī)制的絕好的遺傳材料和基因資源。本研究利用反向遺傳學(xué)等方法獲得了該基因的一系列轉(zhuǎn)基因材料。利用這些材料,采用現(xiàn)代分子生物學(xué)及遺傳學(xué)的方法展開了系統(tǒng)的研究,探尋OsbZIPX介導(dǎo)的水稻開閉穎的分子機(jī)制。本研究主要取得了下面一系列的結(jié)果:1.bzipx植株表現(xiàn)為閉穎自花授粉。OsbZIPX是課題組早期收集的穗期高溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子之一。T-DNA插入突變體bzipx植株相比野生型更加緊湊,葉片直立,且表現(xiàn)為閉花授粉。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)bzipx雖然閉穎,但是開花的其它過程,包括花絲伸長、花藥開裂等均不受影響,因而可以通過花絲狀態(tài)來判斷突變體穎花開花的‘花時’。統(tǒng)計‘花時’結(jié)果表明bzipx日開花時間較野生型遲2小時;漿片形態(tài)觀察表明與野生型開穎時膨脹后的漿片相比,突變體到達(dá)‘花時’時的漿片體積較小、鮮重較輕、表皮細(xì)胞膨脹程度較弱。石蠟切片結(jié)果進(jìn)一步驗證了該觀察結(jié)果,bzipx的漿片在‘花時’相比野生型瘦小,野生型的穎花漿片在開穎時經(jīng)過充分膨脹,漿片外緣有較多組織嵌合入內(nèi)外稃之間,從而撐開勾合,穎花開放;而突變體漿片雖然也有一定程度的膨脹,但是僅僅只有少量的漿片外緣嵌合入勾合不足以撐開內(nèi)外稃,導(dǎo)致閉穎。2.OsbZIPX偏好在穎花中表達(dá),是一個轉(zhuǎn)錄激活子。組織熒光定量PCR顯示OsbZIPX在穎花中,特別是0-2cm的花序中表達(dá)最高。由OsbZIPX啟動子(0-4kbps)驅(qū)動的OsbZIPX與GUS的融合蛋白組織染色顯示融合蛋白在花藥、漿片中大量表達(dá)。酵母轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果顯示,OsbZIPX具有轉(zhuǎn)錄激活功能;亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示OsbZIPX蛋白主要定位在細(xì)胞核內(nèi)。暗示該轉(zhuǎn)錄因子是一個轉(zhuǎn)錄激活子。3.OsbZIPX過表達(dá)植株的葉夾角增大,OsbZIPX的表達(dá)可能與油菜素內(nèi)酯(Brassinosteroids,BR)相關(guān)。OsbZIPX過表達(dá)植株表現(xiàn)為葉夾角增大、種子變大等BR相關(guān)表型,與bzipx突變體表現(xiàn)出的葉型緊湊、葉片直立正好對應(yīng)。我們利用qRT-PCR檢測水稻中BR合成基因的表達(dá),結(jié)果表明過表達(dá)植株中OsCPD基因上調(diào)。石蠟切片顯示過表達(dá)植株的漿片細(xì)胞較野生型有所增大,均一性更好,表明OsbZIPX可能參與BR途徑調(diào)控水稻生長發(fā)育。4.OsbZIPX促進(jìn)開穎過程中JAZs基因的表達(dá)。茉莉酸能促進(jìn)水稻開穎。通過qRT-PCR分析野生型、bzipx、bZIPX過表達(dá)植株在開花前與開花時穎花中JAZs基因的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與野生型相比,突變體中多個JAZs基因的表達(dá)減弱,而過表達(dá)植株中JAZs基因中則顯著增高。雙熒光報告分析實驗顯示OsbZIPX基因可以促進(jìn)部分JAZs基因的表達(dá),表明OsbZIPX在水稻開穎過程中能促進(jìn)茉莉酸信號的傳遞。5.OsbZIPX與OsDLT在酵母中互作。由于全長OsbZIPX蛋白具有很強(qiáng)的自激活活性,而OsbZIPX的蛋白N端(0-265aa)則不具有轉(zhuǎn)錄激活功能,利用OsbZIPX的N端篩選水稻花序cDNA文庫,結(jié)果顯示OsbZIPX的蛋白N端與BR信號傳遞相關(guān)基因OsDLT存在互作。我們推測OsbZIPX可能通過OsDLT參與BR途徑。OsbZIPX與OsDLT的相互作用還有待進(jìn)一步的驗證。綜上所述,OsbZIPX參與調(diào)控水稻開穎的機(jī)制可能是通過協(xié)同調(diào)控BR與茉莉酸途徑來實現(xiàn)的,在水稻花發(fā)育早期,通過促進(jìn)BR合成或信號傳遞促進(jìn)漿片細(xì)胞發(fā)育增大,在開穎時OsbZIPX又通過促進(jìn)茉莉酸途徑的信號傳遞促進(jìn)水稻開穎。后續(xù)我們還將對OsbZIPX如何通過調(diào)控JA和BR信號之間的交叉對話來精細(xì)調(diào)控水稻穎花的開放開展研究,最終為水稻開穎的分子機(jī)制的解析提供基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S511
【圖文】：

水稻開穎的機(jī)制水稻的穎花（小花）由一對護(hù)穎、外稃、內(nèi)稃、1 枚雌蕊(擁有兩個柱頭 枚雄蕊，以及對稱分布于內(nèi)外稃之間、子房基部的一對漿片組成。水稻是自花授粉的作物。水稻穎花開放（圖 1）是由漿片的快速吸水膨脹驅(qū)動的吸水膨脹向外推擠外稃從而分離內(nèi)稃和外稃之間的勾合穎花開放；穎花開同進(jìn)行的還包括了花絲的伸長、花藥開裂散粉、柱頭的彎曲外露等過程；終完成授粉后，較短的時間內(nèi)漿片又迅速的失水萎蔫，穎殼又重新閉合為的發(fā)育及后期灌漿提供一個密閉的空間[70]。因此對水稻開穎的研究主要集開穎前后對漿片的細(xì)胞形態(tài)觀察和膨脹機(jī)制的探究。稻開穎的研究進(jìn)展

31圖 3.1 O sbZIPX 表達(dá)模式a：OsbZIPX 偏好在抽穗期花序中表達(dá)（Genevestigator）； b：OsbZIPX 基因在生殖器官過程中的表達(dá)譜。用的是安捷倫科技公司的單色基因芯片分析系統(tǒng)，將 48 個樣品（每品三個重復(fù)）用于雜交。OsbZIPX 基因的表達(dá)譜用 Cy3 信號強(qiáng)度和標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)（log示。其中數(shù)字表示：1、花序（0.6-1.0mm），2、花序（1.0-1.5mm），3、花序（1.5-2.0mm花序（2.0-2.5mm），5、花序（2.5-3.0mm），6、花序（3.0-4.0mm），7、花序（4.0-5.0mm花序（5.0-10mm），9、花藥（0.3-0.6mm），10、花藥（0.7-1.0mm），11、花藥（1.2-1.5mm、花藥（1.6-2.0mm），13、雌蕊（5-10cm 的圓錐花絮），14、雌蕊（10-14cm 的圓錐花絮、雌蕊（14-18cm 的圓錐花絮），16、外稃（1.5-2.0mm 的小花），17、內(nèi)稃（1.5-2.0小花），18、外稃（4.0-5.0mm 的小花），19、內(nèi)稃（4.0-5.0mm 的小花），20、外稃（7.0小花），21、內(nèi)稃（7.0mm 的小花）；c：不同長度幼穗中 OsbZIPX 基因的表達(dá)情況

3.2 OsbZIPX 突變體的獲得與鑒定實驗室從韓國商業(yè)突變庫購買了 OsbZIPX 的 T-DNA 插入突變體 bzipx（本實驗室命名為突變體 154），遺傳背景為華陽（HY），T-DNA 插入在該基因的第3 內(nèi)含子上（圖 3.2 a），設(shè)計了一對基因特異引物 154R 和 154L 以及 T-DNA 插入邊界引物 LB2 用于鑒定該 T-DNA 插入。基因特異引物（154R，154L）能夠擴(kuò)增出條帶、T-DNA 插入鑒定引物（154L，LB2）不能擴(kuò)增出條帶的是野生型；基因特異引物能擴(kuò)增出條帶、T-DNA 引物也能擴(kuò)增出條帶的是雜合型；而基因特異引物不能擴(kuò)增出條帶，T-DNA 引物能擴(kuò)增出條帶的是插入純合型 bzipx 突變體；如圖 3.2 b 所示，雜合型的有（泳道）：4、6；純合型的有（泳道）：1、2、5、7。實時熒光定量 PCR 顯示，OsbZIPX 的表達(dá)在 T-DNA 插入雜合突變體和純合突變體中表達(dá)下降，甚至阻斷（圖 3.2 c）。

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 劉慧潔;水稻花期特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子OsbZIPX的功能研究[D];浙江師范大學(xué);2019年

本文編號：2771935