【摘要】：苦蕎具Kelch基序的F-box(KFB)蛋白是E3泛素連接酶家族成員SCF(Skp1-Cullin-F-box)復(fù)合物的組分之一,其通過特異性識別靶蛋白使其泛素化降解,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞活動。研究報道KFB蛋白通過控制次生代謝相關(guān)酶的穩(wěn)定性影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,以實現(xiàn)對次生代謝途徑的調(diào)控。本研究對本課題組苦蕎轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的15種苦蕎KFB基因(命名為FtKFB1、FtKFB 2、FtKFB 3、FtKFB 4、FtKFB 5、FtKFB 6、FtKFB 7、FtKFB 8、FtKFB 9、FtKFB 10、FtKFB11、FtKFB 12、FtKFB 13、FtKFB 14、FtKFB15)進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析苦蕎中KFB基因的組織特異性表達。將Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫中的兩種具有次生代謝調(diào)控功能的擬南芥KFB蛋白(At1g80440、At2g44130)與FtKFB1-FtKFB15的氨基酸序列進行比對,因FtKFB7、FtKFB14分別與At1g80440、At2g44130具有44%和41%的一致性,推測FtKFB7、FtKFB14可能與次生代謝調(diào)控有關(guān)。通過酵母雙雜交系統(tǒng)及GST pull-down實驗對FtKFB7、FtKFB14與苦蕎苯丙氨酸解氨酶(FtPAL)及苦蕎蘆丁降解酶(FtRDE)之間的相互作用進行驗證。構(gòu)建植物表達載體,在煙草中實現(xiàn)FtKFB7和FtKFB14基因的過表達,檢測轉(zhuǎn)基因陽性植株的總黃酮含量,以進一步探究FtKFB蛋白在次生代謝途徑中的調(diào)控機制。研究結(jié)果表明:(1)對苦蕎不同組織(根、莖、葉、花、種子)中FtKFB1-FtKFB15的qRT-PCR分析表明FtKFB4、5、6、7、8、9、10、11在葉中表達量最高,分別為根中表達量的10.0、7.1、21.3、7.7、13.4、18.4、1.5、2.4倍;FtKFB2、3、13、14的表達量在種子中最高,分別為根中的1.3、8.5、7.0、10.1倍;FtKFB12在莖中有著最高的表達水平,約為根的2.1倍;FtKFB1在根中表達量最高,而FtKFB15在莖和根中的表達水平接近。表明在苦蕎各組織中不同F(xiàn)tKFB基因存在表達差異。(2)分別構(gòu)建誘餌載體pGBKT7-FtKFB7、pGBKT7-FtKFB14和獵物載體pGADT7-FtPALB、pGADT7-FtPALN、pGADT7-FtRDE,共轉(zhuǎn)化酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞,以pGBKT7-Lam+pGADT7-T作為陰性對照,pGBKT7-53+pGADT7-T作為陽性對照。經(jīng)驗證該酵母雙雜交系統(tǒng)無自激活效應(yīng)。X-α-Gal顯色結(jié)果表明FtKFB7與FtRDE、FtPALN、FtPALB之間都存在相互作用,而FtKFB14只與FtPALB之間有相互作用。通過酵母雙雜交實驗初步證實了FtKFB與FtPAL、FtRDE之間的相互作用,為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。(3)構(gòu)建重組表達載體pGEX-6p-1-FtKFB7、pGEX-6p-1-FtKFB14,經(jīng)GST親和層析純化得到FtKFB7、FtKFB14蛋白;通過鈷離子螯合柱層析成功純化得到PALB蛋白;從苦蕎籽粒中純化得到FtRDE酶粗提液。GST pull-down實驗及Western Blot檢測結(jié)果表明在pull-down洗脫液中成功檢測到FtKFB7與FtPALB或FtRDE蛋白,進一步證實了FtKFB與FtPAL、FtRDE在體外的相互作用。(4)為了進一步研究FtKFB蛋白在植物次生代謝中的功能,構(gòu)建了植物表達載體pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB7和pCAMBIA3301-eGFP-FtKFB14,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草品種SR-1(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)以實現(xiàn)FtKFB7、FtKFB14在煙草中的過表達。本實驗經(jīng)Basta抗性篩選及PCR檢測得到FtKFB7、FtKFB14、pCAMBIA3301-eGFP的T0代轉(zhuǎn)基因陽性植株,并初步測定了T0代pCAMBIA3301-eGFP和FtKFB14轉(zhuǎn)基因植株中的總黃酮含量,結(jié)果表明FtKFB14的過表達可能對黃酮含量起負(fù)調(diào)節(jié)作用,但仍需進一步驗證。該實驗為深入了解苦蕎KFB蛋白對植物次生代謝產(chǎn)物的影響創(chuàng)造了條件。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S517

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本文編號：2771897