【摘要】：甘草具有補(bǔ)脾益氣,清熱解毒,祛痰止咳,緩急止痛等功效,甘草酸是甘草的主要活性成分,甘草酸的含量是《中國(guó)藥典》列入的衡量甘草藥材品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)。甘草酸藥用價(jià)值與工業(yè)價(jià)值顯著,不僅運(yùn)用于臨床治療,還廣泛應(yīng)用于化妝品、食品、保健品等行業(yè)。目前,僅靠種植甘草無(wú)法滿足其巨大市場(chǎng)需求,同時(shí),種植甘草周期長(zhǎng),品質(zhì)優(yōu)劣不一,過(guò)渡采挖甘草造成土地沙化、土壤貧瘠、生態(tài)環(huán)境破壞等嚴(yán)重問(wèn)題,因此,采用新興科學(xué)技術(shù)獲得甘草酸已成為甘草資源研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái),隨著合成生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展,人們對(duì)于甘草酸生物合成途徑的研究日趨成熟,因此,運(yùn)用合成生物學(xué)技術(shù)人工合成甘草酸有望成為緩解甘草酸市場(chǎng)供不應(yīng)求,改善甘草種質(zhì)資源的重要方法。目前,甘草酸生物合成途徑中的關(guān)鍵基因多數(shù)已被成功表征,甘草酸的生物合成通路已基本打通,科學(xué)家已在酵母中合成了甘草酸的前體——甘草次酸。然而,甘草酸中下游途徑中的UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)與細(xì)胞色素P450還原酶(GuCPR)仍未被成功解析。甘草酸糖基轉(zhuǎn)移酶需在UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)催化作用下,方可催化甘草次酸生成終產(chǎn)物甘草酸;甘草酸細(xì)胞色素P450還原酶(GuCPR)為細(xì)胞色素P450的催化過(guò)程提供電子,是細(xì)胞色素P450超家族酶中的重要成員,因此,解析甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)與甘草酸細(xì)胞色素P450還原酶(GuCPR)對(duì)甘草酸的生物全合成至關(guān)重要。因此,本文研究?jī)?nèi)容及主要研究成果如下:1.通過(guò)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)與NCBI上報(bào)道的同源基因比對(duì),篩選出了3條候選甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs),命名為GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3;篩選出了1條甘草酸細(xì)胞色素P450還原酶(命名為GuCPR)全長(zhǎng)編碼序列,并以cDNA為模板,基于PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù),通過(guò)特異性引物擴(kuò)增,克隆了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3與GuCPR的完整編碼區(qū)(CDS),得到了3條1000bp左右和1條2000bp左右的條帶,并通過(guò)連接pEASY-Blunt載體得到GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3與GuCPR的克隆重組質(zhì)粒。基于蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,顯示GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3歸屬于UDP-葡萄糖脫氫酶超家族,GuCPR歸屬于細(xì)胞色素P450還原酶超家族。此外,利用相關(guān)生物信息學(xué)分析方法分析了GuGDHs與GuCPR的基本特性。2.通過(guò)同源重組方法構(gòu)建了GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3的pET-30a(+)原核表達(dá)載體,并在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中異源表達(dá)。通過(guò)IPTG(異丙基硫代半乳糖苷,Isopropy1 β-D-Thiogalactoside)誘導(dǎo)表達(dá),獲得GuGDH1、GuGDH2、GuGDH3重組蛋白。3.通過(guò)酶促反應(yīng)催化實(shí)驗(yàn),檢測(cè)NADPH在340nm處吸光度的增加來(lái)確定甘草酸UDP-葡萄糖脫氫酶(GuGDHs)的活性,證明了GuGDH1、GuGDH2具有活性,而GuGDH3不具有活性。本文研究成果可為下一步解析甘草酸生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.71
【圖文】：

圖１－１甘草三萜類化合物逡逑ａ．甘草酸ｂ．甘草次酸逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｃｏｍｐｏｕｎｄ邋ｏｆ邋Ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ邋ｆｒｏｍ邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ邋ｕｒａｌｅｎｓｉｓ逡逑ａ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｃ邋ａｃｉｄ邋ｂ．邋Ｇｌｙｃｙｒｒｈｅｔｉｎｉｃ邋ａｃｉｄ逡逑１．２黃酮類成分逡逑甘草黃酮同樣有抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、抗氧化等顯著的藥理活性。近年逡逑來(lái)，甘草黃酮的抗ＨＩＶ病毒作用多見報(bào)道。以甘草總黃酮測(cè)定經(jīng)大鼠小腸吸收逡逑前后ＨＩＶ病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和ＨＩＶ病毒整合酶的活性，結(jié)果表明甘草總黃酮經(jīng)大鼠逡逑小腸吸收后的供試液不具有抗ＨＩＶ病毒活性，進(jìn)而表明甘草總黃酮的抗ＨＩＶ病逡逑毒作用Ｍ。此外，研宄表明，甘草葉中富含的甘草總黃酮可以誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞逡逑

析蛋白的結(jié)構(gòu)．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／ｂｅｒｒｙ．ｐｈｔｍＬ邋？ｔｏｐｉｃ＝進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。ｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。逡逑取逡逑如下圖所示，１８Ｓ和２８Ｓ兩條較高，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。逡逑

的ＲＮＡ質(zhì)量較好，完整性較高，可用于下一步實(shí)驗(yàn)。逡逑ｒ逡逑圖３－１甘草總ＲＮＡ提取結(jié)果逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋Ｌｉｃｏｒｉｃｅ逡逑３１逡逑

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