【摘要】：鈣依賴蛋白激酶(CPK)家族在調(diào)控植物生長、發(fā)育與物質(zhì)合成等過程中發(fā)揮了重要功能。然而,一些CPK成員生物學(xué)功能尚未闡明。在本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),鈣依賴性蛋白激酶TaCPK34在小麥籽粒灌漿期間高表達。因此,推測TaCPK34在籽粒灌漿期發(fā)揮了重要功能。為了證實上述猜測,本研究從小麥中首次克隆到TaCPK34基因,對基因的序列和特性進行分析;利用大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(BSMV-VIGS)研究了TaCPK34功能的研究。主要結(jié)果如下:(1)本研究分離出TaCPK34基因的cDNA序列,它編碼了518個氨基酸,包含了CPKs家族所共有的四個保守結(jié)構(gòu)域。進化樹比對結(jié)果顯示,該激酶屬于CPKs第Ⅱ亞族。農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片結(jié)果表明,它定位在細胞膜上,具有鈣依賴性蛋白激酶的特征。實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)測定結(jié)果表明,在20%PEG6000誘導(dǎo)的水分脅迫、100μM脫落酸(abscisic acid,ABA)、100μM茉莉酸甲酯(jasmonic acid,JA)和100μM水楊酸(salicylic acid,SA)等處理后,編碼該激酶基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高,暗示它參與了小麥干旱脅迫過程,并受ABA和JA等激素調(diào)控。(2)利用BSMV-VIGS技術(shù)獲得BSMV-VIGS-TaCPK34短暫性沉默小麥植株。自然干旱脅迫14 d后,發(fā)現(xiàn)TaCPK34基因沉默小麥植株對干旱脅迫更為敏感,從而負向驗證了該激酶在小麥干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。利用iTRAQ蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)辨析了干旱脅迫BSMV-VIGS-TaCPK34沉默小麥植株中的差異蛋白,共辨析出39個蛋白的表達豐度表現(xiàn)出顯著差異(≥1.50或≤0.68 fold,P0.05),這些蛋白參與了脅迫與防御、碳水化合物代謝、核苷酸代謝、光合作用、運輸、蛋白代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種功能,推測TaCPK34可能參與調(diào)控這些蛋白的表達,進而提高了小麥對干旱脅迫的抗性。(3)在大田條件下對灌漿期小麥穗部進行BSMV-VIGS-TaCPK34病毒載體接種,以驗證TaCPK34在小麥淀粉合成過程中的功能。結(jié)果顯示,在花后15 d、20 d、26 d和30 d,BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株中TaCPK34基因表達量受到顯著抑制(63.8%-97.8%);BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒淀粉含量、千粒重、粒長和粒寬均顯著降低(降幅分別為6.0%、7.1%、4.4%和11.0%);掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)BSMV-VIGS-TaCPK34沉默植株成熟籽粒內(nèi)淀粉粒排列疏松且數(shù)量減少。這些結(jié)果表明TaCPK34也可能參與了小麥淀粉合成的調(diào)控。
【學(xué)位授予單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S512.1
【圖文】：

圖 4.2 TaCPK34 基因 ORF 擴增，DL2000 marker 1, 以小麥 cDNA 為模板擴增 TaCPK34 OFig.4.2 Amplification ORF of TaCPK34 gene.ents DL2000 marker; 1 represents amplificaton ORF of TaCPK34 gene withGGCCGGCCGGGGGGAATTCCCCGGGGGGGGAATTGGCCGGGGAAGGCCCCCCGGAAGGGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGAACCCCCCCCTTCCCCAACCGGCCGGCCCCGGCCGGCCCCGGGGCCGGCCCCTTCCCCGGTTCCCCAAGGGGCCCCGGGGCCGGGGCCGGCCGGGGCCCCGGCCCCAATTCCGGGGCCCCCCCCGGTTTTCCTTCCGGGGCCCCGGCCCCCCCCAATTGGGGAAGGGGAACCGGTTGGCCGGCCAAGGCCAATTCCTTAACCAACCCCGGTTCCGGGGCCAAAAGGGGAAGGCCTTTTGGGGCCCCGGCCGGGGCCCCCCGGGGGGCCCCAAGGAAAAGGTTTTCCGGCCCCTTGGCCAAAAGGAACCCCAATTCCGGCCCCAAAAGGCCGGCCAAAAGGCCTTGGTTCCCCA

EF 手性結(jié)構(gòu)有保守的結(jié)構(gòu)域氨基酸（DDSE 和 DDDE）。MGNCCAGSGDAEPEAAADPSTRRAG....................ASVQAGGASPSSAPAQNKPPAAIGPVLMGQCCTGGGKAVAGDEAEPGTSKAAPPSRGTSSKNGSAKQQPCSPAAKAAATEAAAAASSSKKPAGPIGEVLMGHRHSKSKSSDPPPSSSSSSSGNVVHHVKPAGE.....RRGSSGSGTVGSSGSGTGGSRSTTSTQQNGRILMEDVRSIYTVGKELGRGQFGITSLCTHKATGQKFACKTIAKRKLSTKEDVEDVRREVQIMYHLAGQPNIVELMEEVRTTYSIGKELGRGQFGVTHLCTHKATGEKLACKTIAKRKLANKEDVDDVRREVQIMHHLSGQPNIVDLMEEVRRTYEFGRELGRGQFGVTYLVTHKETKQQVACKSIPTRRLVHKDDIEDVRREVQIMHHLSGHRNIVDLYEDKQSVHLVMELCAGGELFDRIIAKGKYTERAAAALLRTIVEIIHTCHSLGVIHRDLKPENFLLLSKEEDAYEDKHNVHLVMELCAGGELFDRIIARGHYTERAAAALLRAIVGIVHTCHSMGVIHRDLKPENFLLLSKGDDAYEDRHSVNLIMELCEGGELFDRIISKGLYSERAAADLCRQMVMVVHSCHSMGVMHRDLKPENFLFLSKDENSATDFGLSVFYKQGEVFKDIVGSAYYIAPEVLKRNYGPEADIWSVGVIVYILLCGVPPFWAESEHGIFNSILRATDFGLSVFFKEGEVFRDIVGSAYYIAPEVLKRKYGPEADIWSIGVMLYIFLAGVPPFWAESENAIFTAILRATDFGLSVFFKPGDKFKDLVGSAYYVAPEVLKRNYGPEADIWSAGVILYILLSGVPPFWGENETGIFDAILQDFSSDPWPRISPGAKDLVRKMLNSDPKKRISAYDVLNHPWIKEDGEAPDTPLDNAVMNRLKQFKAMNQFKKADLASEPWPKISSGAKDLVRKMLNINPKERLTAFQVLNHPWIKEDGDAPDVPLDNVVLNRLKQFRAMNQFKKADFSADPWPALSDGAKDLVRKMLKYDPKDRLTAAEVLNHPWIREDGEASDKPLDNAVLSRMKQFRAMNKLKKMVIAGCLSEEEIRGLKEMFKSMDSDNSGTITVDELRKGLGKQGTKLTEAEVEQLMEAADADGSGTIDYEEFITIIAGCLSEEEIKGLKEMFKNIDKDNSGTITLEELKNGLAKQGTKFSDNEIEQLMEAADADGNGIIDYEEFVTVIAENLSEEEIIGLKEMFKSLDTDNNGIVTLEELRTGLPKLGSKISEAEIRQLMEAADMDGDGSIDYLEFISHMNRMDREEHLYTAFQYFDKDNSGYISKEELEQALREKGLLDGRDMNEIVSEVDADNDGRIDYSEFVAMMRKHMNKMDREEHLYTAFQYFDKDNSGYITKEELE

2018 年河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文為了進一步探究 TaCPK34 蛋白與其他物種蛋白的同源進化關(guān)系，現(xiàn)選用小麥（Triticuivum L.）擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）四個的鈣依賴性蛋白激酶與 TaCPK34 蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹關(guān)系圖（圖 4.4）。鈣依賴性蛋白大家族總共分為四個亞族，分別是第Ⅰ亞族、第Ⅱ亞族、第Ⅲ亞族和第Ⅳ亞族。TaCPK3sCPK25 和 AtCPK6 親緣關(guān)系最近，屬于第Ⅱ亞族。 TaCPK34 亞細胞定位利用預(yù)測用 NMT (http://mendel.imp.ac.at/myristate/SUPLpredictor. htm)在線網(wǎng)站預(yù)測PK34 的 N 末端豆蔻乙�；稽c，發(fā)現(xiàn) TaCPK34 與 OsCPK25 和 AtCPK6 一樣，在 N 端區(qū)存在一個豆蔻乙酰化位點（圖 4.4 A），推測該蛋白激酶可能定位在細胞膜上。將S::GFP 和 p53S::TaCPK34::GFP 瞬時轉(zhuǎn)化煙草葉片中，通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)S::TaCPK34::GFP 融合蛋白特異的定位于細胞膜上，而 p53S::GFP 對照在整個細胞中分說明 TaCPK34 是一個膜定位蛋白（圖 4.5）。A

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 葉興國;徐惠君;杜麗璞;何光源;王軻;林志珊;;小麥規(guī)�；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系構(gòu)建及其應(yīng)用[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2014年21期

2 暢文軍;付桂;陳鑫;朱家紅;張治禮;;番茄鈣依賴性蛋白激酶基因LeCPK2在熱(光)脅迫中的功能鑒定[J];基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué);2011年04期

本文編號：2768157