【摘要】：茉莉酸(jasmonic acid,JA)是植物體內(nèi)一種重要的激素,它不僅作為內(nèi)源激素調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育,而且還可作為信號分子調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。茉莉酸的生物合成是通過脂氧(Oxylipin)信號途徑中的丙二烯氧化物合成酶(AOS)分支來實現(xiàn)的。12-氧-植物二烯酸還原酶(OPR)和脂肪氧化酶(LOX)是茉莉酸生物合成途徑中的兩個關(guān)鍵酶。OPR控制JA合成的最后步驟,將OPDA還原生成JA的前體,而LOX控制JA合成的初始步驟,將不飽和脂肪酸氧化成氫過氧化物。目前,已有學者對擬南芥、番茄及少數(shù)其它物種中的OPR和LOX進行了鑒定和功能研究,但小麥OPR和LOX家族基因的鑒定和生物學功能尚未完全明晰。本研究對小麥OPR和LOX基因家族進行了全基因組鑒定,分析了家族基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序等,探究了啟動子的順式作用元件、基因的組織特異性表達及其對各種生物和非生物脅迫的響應(yīng),并進一步利用小麥轉(zhuǎn)基因材料解析了TaOPRIII-7和TaLOX11-6A的生物學功能,所獲得的主要研究成果如下:1.從小麥全基因組中共鑒定到48個OPR家族基因,其均含有Oxidored_FMN蛋白保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),48個小麥OPR基因可分為5個亞家族(sub.I-V),亞家族I-V中分別包括6、4、33、3和2個OPR基因,亞家族III中擁有的OPR基因數(shù)量最多。同一亞家族基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序。啟動子順式作用元件分析表明,小麥OPR基因主要與生長發(fā)育、激素調(diào)控及生物和非生物脅迫的響應(yīng)有關(guān)。48個小麥OPR基因分布在小麥21條染色體中的15條上,其中染色體3A、3B、3D、4A、5D和6A上無OPR基因分布。小麥OPR基因中,有14個是串聯(lián)復(fù)制基因,37個為片段復(fù)制基因,表明基因復(fù)制對OPR基因家族的擴大有重要意義。小麥OPR基因的表達具有組織特異性,在5個組織(根、葉、莖、穗和籽粒)中的至少一種組織有表達。OPR基因?qū)?yīng)激具有特異性,其表達受植物激素(MeJA、ABA和SA)和各種脅迫(干旱、熱、鹽、機械傷害和蚜蟲)的調(diào)控或誘導(dǎo)。由此可見,小麥OPR基因家族是一個多功能的基因家族。2.小麥TaOPRIII-7基因位于2號染色體上,其在根、莖、葉片、穗和籽粒中均有表達,且在根和葉片中有較高水平的表達(根葉片)。qRT-PCR結(jié)果顯示,TaOPRIII-7可對生物脅迫(蚜蟲)和非生物脅迫(干旱、熱、鹽和機械傷害)做出響應(yīng)。利用發(fā)夾RNA沉默載體將TaOPRIII-7基因沉默,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株花藥不能正常開裂,花粉育性和種子結(jié)實率顯著降低,這表明TaOPRIII-7參與雄性器官的發(fā)育。TaOPRIII-7基因沉默提高了小麥對麥二叉蚜的抗性,表現(xiàn)為:(1)與轉(zhuǎn)基因植株相比,蚜蟲更偏好野生型植株,且在轉(zhuǎn)基因植株中的趨避率要顯著高于野生型;(2)蚜蟲在轉(zhuǎn)基因植株中的非刺探時間和木質(zhì)部取食時間增加,而韌皮部取食時間減少;(3)進一步研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因植株韌皮部篩管中胼胝質(zhì)的沉積顯著增加,防御相關(guān)基因GSL表達量也明顯提高,這說明TaOPRIII-7基因激活的是韌皮部誘導(dǎo)的蚜蟲防御;(4)在TaOPRIII-7基因沉默植株中,葉片中OPDA含量顯著上升,表明OPDA在抗蚜蟲防御中可能發(fā)揮重要作用。此外,沉默TaOPRIII-7基因的小麥植株對干旱脅迫具有更強的抗性。3.小麥LOX基因家族共鑒定到50個成員,可分為9-LOX和13-LOX兩個亞家族。基因結(jié)構(gòu)和蛋白基序較為保守,但個別結(jié)構(gòu)的不同和蛋白基序的缺失可能是導(dǎo)致其功能多樣性的原因之一。TaLOX在染色體上非隨機分布,它們定位于21條小麥染色體中的19條上,其中42個TaLOX基因位于2、4、5和6號染色體上。50個TaLOX基因中有40個是復(fù)制產(chǎn)生的,這表明基因復(fù)制在LOX基因家族的擴大中發(fā)揮重要作用。TaLOX啟動子中含有多種與轉(zhuǎn)錄、細胞周期、發(fā)育、激素和脅迫相關(guān)的順式作用元件,且很多為激素和脅迫相關(guān)元件,例如MeJA、ABA、GA、SA、IAA、ET、缺氧誘導(dǎo)、損傷、病原菌、干旱、光照、低溫和光響應(yīng)元件等。TaLOX基因在5個組織(葉、根、莖、穗和籽粒)中的至少一個組織中有表達,其表達具有組織特異性。根據(jù)RNA-seq和qRT-PCR的結(jié)果,LOX基因可參與小麥多種激素和脅迫反應(yīng),且具有不同的表達模式,其表達可被干旱、熱、鹽、蚜蟲、ABA和SA等誘導(dǎo)。4.TaLOX11-6A基因定位于6A染色體上,屬于9-LOX亞家族。TaLOX11-6A基因在小麥5個組織(葉、根、莖、穗和籽粒)中都有表達。通過qRT-PCR試驗發(fā)現(xiàn),TaLOX11-6A基因可響應(yīng)干旱、鹽、蚜蟲、ABA和SA等因素的刺激。過表達TaLOX11-6A的轉(zhuǎn)基因小麥提高了對干旱脅迫的抗性,轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的根系生長速度明顯快于野生型。過表達TaLOX11-6A基因可提高TaPLD基因及茉莉酸合成途徑中部分TaLOX和TaOPR基因的表達量。小麥TaLOX11-6A過表達可減緩干旱脅迫后葉綠素下降的速度,增加脯氨酸的積累,減少丙二醛的合成量,還可提高SOD的活性,繼而增強ROS的清除能力。本研究表明,TaLOX11-6A對干旱脅迫的耐受性主要通過JA和其它信號通路,加強細胞膜的穩(wěn)定性,減少膜損傷及降低ROS帶來的氧化損傷來實現(xiàn)。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S512.1
【圖文】：

其水平遠遠高于機械損傷引起的ET含量（von Dah昆蟲抗性中的功能主要通過微調(diào) JA 誘導(dǎo)的反應(yīng)。在番茄中轉(zhuǎn)錄積累（Odonnell et al. 1996）。利用合成ET的供體乙烯利處JA 和 AOS 的水平（Dietmar and Weiler 1998）。ET 對 JA 誘導(dǎo)在一項關(guān)于擬南芥的研究中，ET 對一種廣譜昆蟲的抗性具 2000）。電位技術(shù)圖譜（electrical penetration graph, EPG）是對刺吸式口器昆蟲和分析的技術(shù)。在刺探過程中，蚜蟲的活動和口針的位置都（胡想順等 2006）。該技術(shù)可用來研究蚜蟲在人工飼料上的定位和轉(zhuǎn)基因植物對蚜蟲取食行為的影響等。測試昆蟲通在 EPG 儀器上，植物土壤中也有一個連接 EPG 儀器的輸出物時，該回路接通（圖 1-1）。昆蟲不同部位的取食活動會引變化經(jīng)儀器轉(zhuǎn)化并以不同波形被記錄。截至目前，已有 7 種得到鑒定。

第一章 文獻綜述蚜蟲接觸植物后，首先分析植物表面的物理和化學信息，再決定是否取食。當沒有刺探行為時，此時電路未接通，顯示為 np 波。當蚜蟲取食時，會在植物表面分泌少量膠狀唾液，并將口針從細胞間刺入植物表皮，沿細胞間隙最終到達維管束。EPG信號在蚜蟲口針到達維管束之前表現(xiàn)為機械穿刺和膠狀唾液分泌的循環(huán)活動，波形為A、B 和 C（圖 1-2；Tjallingii 2006）。在蚜蟲沿細胞間隙刺探過程中，會短暫地（5-10s）刺入細胞，而后又很快將口針抽出，繼續(xù)沿細胞間刺探。細胞內(nèi)刺探表現(xiàn)為電位下降的 Pd 波形（Tjallingii and Esch 1993）。當蚜蟲的口針到達韌皮部時，蚜蟲先分泌水狀唾液，波形為 E1 波，持續(xù)時間約 1 min。E1 波后，蚜蟲會被動吸食韌皮部汁液，此時蚜蟲還在不斷分泌唾液（E2 波），唾液隨吸食的汁液在高壓下被動進入蚜蟲消化道（Tjallingii 2006）。G 波為蚜蟲口針在木質(zhì)部主動吸食植物汁液的波形。

西北農(nóng)林科技大學博士學位論文氧類（oxo-）、酮脂肪酸或揮發(fā)性醛類，它們可能作為第二信使，或作為有機體間信號傳遞的信使，甚至作為殺菌劑發(fā)揮各種生物學功能（Mosblech et al. 2009）。這些氧化脂類化合物的產(chǎn)生，可使植物更好地響應(yīng)多種環(huán)境刺激和發(fā)育信號（Dave andGraham 2012）。Oxylipin 信號途徑包括 8 個主要分支，包括 α-DOX（α-Dioxygenase,α-DOX）途徑、還原酶（reductase）途徑、環(huán)氧乙醇合酶（EpoxyAlcohol Synthase, EAS）途徑、過氧羥基脂肪酸羥化環(huán)氧化酶（Peroxygenase, PXG）途徑、氫過氧化物裂解酶（Hydroperoxide Lyase, HPL）途徑、丙二烯氧化物合成酶（Allene Oxide Synthase,AOS）途徑、乙烯醚合酶（Divinyl Ether Synthase, DES）途徑和脂肪氧化酶（Lipoxygenase,LOX）途徑（Feussner and Wasternack 2002; Mosblech et al. 2009）。Oxylipin 參與多種信號傳導(dǎo)過程，是植物信號網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。

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