【摘要】：目的:構(gòu)建白及轉(zhuǎn)錄組Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù),為白及及其近緣物種的功能基因、代謝組、蛋白組及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究提供堅(jiān)實(shí)的資源基礎(chǔ)。并通過(guò)已構(gòu)建Unigenes文庫(kù)進(jìn)行白及EST-SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)、驗(yàn)證和應(yīng)用,為白及遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定及分子輔助育種等方面的研究奠定一定實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。方法:首先,在已獲得白及全生長(zhǎng)時(shí)期的全組織器官轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,利用Trinity進(jìn)行De Novo組裝,并將所得全部Unigenes進(jìn)行功能注釋分析;隨后再利用MISA及Primer 3.0在線(xiàn)程序分別進(jìn)行EST-SSRs位點(diǎn)掃描和相關(guān)引物設(shè)計(jì)(每個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)三對(duì)引物);并在完成白及基因組DNA提取方法及其EST-SSR-PCR體系的優(yōu)化后,從中隨機(jī)選取100對(duì)引物(每位點(diǎn)隨機(jī)選取1對(duì)引物)在四份白及材料中進(jìn)行種內(nèi)擴(kuò)增驗(yàn)證,并針對(duì)其中的多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)一步利用兩個(gè)近緣屬的6份材料進(jìn)行種間通用性檢測(cè);最后,選取擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果中穩(wěn)定且擴(kuò)增條帶在預(yù)期范圍內(nèi)的引物對(duì)已收集的23份白及種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性的評(píng)價(jià)分析。結(jié)果:1.白及Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建及其功能注釋分析已得白及原始轉(zhuǎn)錄組序列經(jīng)過(guò)濾處理后共得到106,054,784條Clean reads。隨后,將所得Clean reads上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(SRA:SRR7058048),并利用Trinity軟件進(jìn)一步組裝構(gòu)建得到首個(gè)包含127,261條Unigenes的白及核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)(TSA:SUB427309),平均Unigenes長(zhǎng)612 bp。進(jìn)一步功能注解表明,共成功注釋Unigene 67,494條,注釋率為53.04%。2.白及EST-SSR位點(diǎn)挖掘及其引物標(biāo)記開(kāi)發(fā)利用MISA在線(xiàn)軟件共從15,433條unigenes中檢索得到EST-SSRs位點(diǎn)18,335個(gè)(去除復(fù)合型位點(diǎn)778個(gè)),平均每4.35 kb分布有一個(gè)EST-SSR位點(diǎn)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),本研究中白及EST-SSRs以單核苷酸重復(fù)最為豐富(9,128 49.78%),其次為二核苷酸重復(fù)(4,884 26.64%)和三核苷酸重復(fù)(4,166 22.72%)。在各重復(fù)類(lèi)型分布特征統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn),出現(xiàn)頻率較高的核苷酸類(lèi)型分別為單核苷酸A/T(8,996 98.55%),二核苷酸AG/CT(3,286 17.92%),其次為三核苷酸中的AAG/CTT(1,020 5.56%)。最后,以檢索出的18,335個(gè)EST-SSRs位點(diǎn)序列為基礎(chǔ),利用Primer 3.0成功設(shè)計(jì)引物25,935對(duì)。3.白及EST-SSR標(biāo)記的可用性及種間通用性檢測(cè)100對(duì)隨機(jī)引物的可用性驗(yàn)證結(jié)果顯示,共87對(duì)能夠成功擴(kuò)增,其中63對(duì)的擴(kuò)增條帶符合預(yù)期長(zhǎng)度(100~300 bp),25對(duì)引物在所試材料中具有明顯多態(tài)性。種間通用性擴(kuò)增結(jié)果表明,其中2對(duì)標(biāo)記(ZYBS-1,ZYBS-52)在蝴蝶蘭屬和石斛屬中均能成功擴(kuò)增,而ZYBS-14只能在蝴蝶蘭屬中擴(kuò)增,ZYBS-18和ZYBS-60則只能在石斛屬材料中擴(kuò)增。4.白及基因組DNA提取方法優(yōu)化基于以往基因組DNA提取方法的相關(guān)研究,首先選擇常用的CTAB法進(jìn)行白及基因組DNA提取方法的優(yōu)化分析。通過(guò)與TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒、ZOMANBIO植物基因組DNA提取試劑盒和SDS法三種方法所提基因組DNA的UV光譜及瓊脂糖凝膠電泳(AGE)檢測(cè)結(jié)果比較得知,改良CTAB法相比其他方法提取的DNA質(zhì)量和產(chǎn)率均較高(A260/A280=1.82,A260/A230=2.09,C_(產(chǎn)率)(μg/g)=160.68μg/g)。同時(shí),EST-SSR的擴(kuò)增結(jié)果亦證明改良CTAB法提取的DNA完全滿(mǎn)足EST-SSR標(biāo)記相關(guān)的擴(kuò)增研究。此外,ITS2序列擴(kuò)增結(jié)果表明,改良CTAB法提取的基因組DNA能夠很好擴(kuò)增,但在SDS法提取的DNA中不能有效擴(kuò)增。5.白及EST-SSR-PCR優(yōu)化體系的構(gòu)建通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)白及EST-SSR-PCR 10μL擴(kuò)增體系的三個(gè)關(guān)鍵因素(模板DNA濃度、引物濃度和2×PCR mix用量)在三水平上進(jìn)行配比尋優(yōu),最終得出10μL白及EST-SSR-PCR體系中模板DNA濃度、引物濃度和2×PCR mix用量的最優(yōu)配比為:1.60 ng.μL~(-1):2μM:6.98μL。驗(yàn)證結(jié)果表明,該優(yōu)化比在10μL和25μL兩種驗(yàn)證體系中均能擴(kuò)增出穩(wěn)定且背景清晰的條帶,說(shuō)明本研究得到的優(yōu)化組合較為穩(wěn)定,且完全滿(mǎn)足白及后續(xù)基于EST-SSR的相關(guān)研究。6.所開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記在白及遺傳多樣性研究中的應(yīng)用依據(jù)引物可用性驗(yàn)證結(jié)果共選取52對(duì)標(biāo)記,以23份供試白及為模板進(jìn)行擴(kuò)增,6%非變性PAGE凝膠電泳分離結(jié)果顯示,其中25對(duì)具有明顯多態(tài)性,共擴(kuò)增位點(diǎn)108個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)91個(gè),等位變異范圍1-8個(gè)。GS聚類(lèi)分析結(jié)果與主坐標(biāo)聚類(lèi)分析結(jié)果有著高度一致性,均能將23份材料歸至三個(gè)亞群(第一類(lèi)群包含編號(hào)為1、2、3、4、5、6、7的七份栽培白及,第二類(lèi)群包括編號(hào)為8、9、10、11、12、13、14、15的8份貴州正安縣野生白及,第三類(lèi)群包含編號(hào)為16、17、18、19、20、21、22、23的8份貴州修文縣野生白及)。結(jié)論:本研究利用不同生長(zhǎng)時(shí)期的白及材料通過(guò)高通量轉(zhuǎn)錄本測(cè)序技術(shù)成功構(gòu)建起了第一個(gè)白及轉(zhuǎn)錄組Unigenes數(shù)據(jù)庫(kù),并開(kāi)發(fā)了EST-SSR候選引物標(biāo)記25,935對(duì),不僅為白及后續(xù)功能基因組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)及分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和利用等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的資源基礎(chǔ),亦為其近緣物種的相關(guān)研究提供了重要參考和新思路。同時(shí),通過(guò)所開(kāi)發(fā)標(biāo)記在23份白及材料遺傳多樣性研究中的應(yīng)用,更為后續(xù)基于EST-SSR分子標(biāo)記的白及相關(guān)研究奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S567.239
【圖文】：

Raw reads Total raw reads 109,714,290Clean reads 總 clean reads 數(shù) 106,054,784總 clean 核苷酸數(shù) (nt) 13.26 GQ20 (%) 95.69%Q30 (%) 91.49%GC 含量 (%) 47.87%Unigenes 總 Unigene 條數(shù) 127,261總序列長(zhǎng)度 (Kb) 79,698最長(zhǎng) Unigene 長(zhǎng)度(bp) 21,950最短 Unigene 長(zhǎng)度(bp) 201平均 Unigenes 長(zhǎng)度 (bp) 612N50 (bp) 957N90 (bp) 249成功注釋的 Unigenes 數(shù)(條) 67,494進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（圖 1），隨著 unigenes 長(zhǎng)度的增加其數(shù)量具有明顯下降的趨勢(shì)，其中200-500 bp的Unigene占68.03%（88,532），1001-2000 bp包含Unigene13,459 條，而長(zhǎng)度達(dá) 2000 bp 以上僅 6,751 條（5.19%）。

355 38.78NT 34,751 27.31KO 20,764 16.32Swiss-Prot 40,109 31.52PFAM 40,920 32.15GO 41,818 32.86KOG 24,615 19.34成功注釋的 Unigene 總數(shù) 67,494 53.04合計(jì) 127,261 100.00其中，GO 注釋通過(guò)國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)模型 Blast 2 GO 程序完成，共涉及生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能三大范疇（圖 2）。由圖 2 可知，細(xì)胞組分范疇以 cell（13,310，31.83%）、cell part（13,302，31.81%）為主，生物學(xué)過(guò)程以 cellularprocess（23,257，55.61%）、metabolic process（23,124，55.30%）和 single-organismprocess（17,570，42.02%）三簇的 unigenes 最多，而分子功能范疇則以 binding（21,760，52.04%）、catalytic activity （19,082，45.63%）為最。

遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 陳紅波KOG 注釋顯示，共 24,615（19.34%）條 unigene 成功歸入 26 個(gè) Ortholog 簇（圖 3）。其中以 R（General function prediction only）、O（Posttranslational modification,protein turnover, chaperones）、J（Translation, ribosomal structure and biogenesis）三簇 Unigene 最多，分別有 3,889（15.80%）、3,240（13.16%）、2,931（11.91%）條。

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本文編號(hào)：2760459