【摘要】：丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge)是一種唇形科鼠尾草屬多年生草本植物,其干燥根及莖作為我國傳統(tǒng)藥材已經(jīng)廣泛應(yīng)用于冠心病、慢性腎功能衰竭、動脈硬化等疾病的預(yù)防和治療。本研究以SmJAZ8作為誘餌蛋白,通過酵母雙雜交篩選與其互作的轉(zhuǎn)錄因子,為后續(xù)探討JASMONATE ZIM-DOMINE(JAZ)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控丹參酮類和酚酸類物質(zhì)合成的作用奠定基礎(chǔ)。本研究取得以下研究結(jié)果:1?通過獲得丹參各組織器官總RNA進一步制備了丹參全長均一化AD文庫?本研究所構(gòu)建的酵母文庫的滴度大于1×10~7 cfu/mL,酵母文庫庫容為3.1×10~7 cfu/mL,平均插入片段大于1.0 kb?2?以BD-SmJAZ8為誘餌載體,酵母雙雜交篩選酵母AD(均一化)文庫,獲得289個克隆?其中一個標號為8-6的克隆通過BLASTX分析表明是一個bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子,將其命名為SmbHLH128。3?通過雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)驗證SmJAZ8與篩選到的轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH128確實存在互作關(guān)系。隨后截短SmJAZ8結(jié)構(gòu)域,通過酵母雙雜交驗證了SmbHLH128與SmJAZ8的相互作用區(qū)域在SmJAZ8蛋白的Jas結(jié)構(gòu)域?4?驗證SmJAZ8互作轉(zhuǎn)錄因子SmbHLH128的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域在其轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(TAD,Transcriptional Activation Domain)?構(gòu)建SmbHLH128轉(zhuǎn)錄因子基因過表達載體和顯性抑制SRDX表達載體,獲得過表達轉(zhuǎn)基因毛狀根株系10個,顯性抑制表達毛狀根株系11個?通過熒光顯微鏡鑒定和qPCR分析確定轉(zhuǎn)基因陽性毛狀根的獲得。
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S567.53
【圖文】：

第一章 文獻綜述物質(zhì)的合成，通過酵母雙雜交驗證這些轉(zhuǎn)錄因子與 JZ8和 JAZ8 互作轉(zhuǎn)錄因子的相互作用。酵母雙雜交分相互作用區(qū)域。實驗驗證 JAZ8 互作轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性。通過 4m表達技術(shù)，構(gòu)建 pGWB18-SmbHLH128 融合過表達載DX 顯性抑制載體，進行丹參毛狀根的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)

西北農(nóng)林科技大學碩士學位論文核酸了 260/230 比值小于 2.0 說明樣品中有異硫氰酸胍 β-巰基乙醇或乙上結(jié)果說明我們提取的樣品符合 RNA 比值范圍，表明 RNA 比較純，滿將這 12 種 RNA 樣品等比例混合為 100 μL，NanoDrop 檢測結(jié)果 260/28260/230 比值為 2.15，濃度為 0.141 2 μg/μL 結(jié)果為 A 類，質(zhì)量滿足實驗

第二章 酵母均一化 cDNA文庫的構(gòu)建丹參根；2：莖；3：葉；4：花；5：未處理毛狀根； 6：100 μmol/L MeJA；7： 5： 100 μmol/L 赤霉素；9： 50 μmol/L 乙烯；10： 22.5 mg/mL 水楊酸；11： 0.1 m物；12： 15 μmol/L Ag+；13：1-12 號 RNA 樣本等比例混合；A：質(zhì)量滿足實S>=1 且 A260/A280 介于 1.8-2.2) 均一化效果檢測過 DSN 處理后，電泳呈現(xiàn)一條均勻的彌散條帶，均一化前的亮帶已基散條帶至 1000-2000 bp 之間，說明均一化使原本豐度較低的 cDNA相對加，而高豐度 cDNA 含量明顯下降(圖 2-2 A/B) 為進一步檢測此現(xiàn)象，環(huán)后，DSN 均一化處理后的 cDNA 二次放大檢測，18sRNA 的表達豐度化之前(圖 2-2 B/C) 以 1/4 DSN 和 control 為模板，用 18S 管家基因進行電泳后用 Tanon GIS 軟件分析灰度，結(jié)果顯示本文庫均一化后比非均一 25倍以上(圖 2-2 D) 以上結(jié)果表明，均一化處理有效降低了高豐度基因一化的 cDNA質(zhì)量良好，可進一步用于文庫構(gòu)建

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本文編號：2760419