【摘要】：類(lèi)胡蘿卜素(carotenoids)是一類(lèi)重要的天然色素的總稱(chēng),是一類(lèi)脂溶性色素,普遍存在于動(dòng)物、高等植物、真菌、藻類(lèi)之中。類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)光合色素,同時(shí)也是植物花、果實(shí)等的重要呈色因子之一。八氫番茄紅素合成酶(PSY)是類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中的第一個(gè)限速酶,它能催化r{牛兒基r{牛兒基焦磷酸(GGPP)轉(zhuǎn)化形成八氫番茄紅素。在玉米胚乳、水稻胚乳、馬鈴薯塊莖、番茄果實(shí)、油菜籽中超量表達(dá)PSY基因能顯著提高類(lèi)胡蘿卜素的含量,提高農(nóng)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。類(lèi)胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCO)催化類(lèi)胡蘿卜素的降解,是影響類(lèi)胡蘿卜素含量的重要因子。棉花(Gossypium)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物,棉纖維是紡織工業(yè)中使用最多的天然纖維,在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。天然彩色棉具有免印染,污染小等優(yōu)勢(shì)。但是,色彩單一和呈色穩(wěn)定性差,嚴(yán)重制約了彩色棉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。培育色彩豐富、呈色穩(wěn)定的彩色棉新材料具有重要的理論意義和良好的應(yīng)用前景。在前期獲得轉(zhuǎn)基因材料的基礎(chǔ)上,本文首先對(duì)Fbl2A::GhPSY2D轉(zhuǎn)基因棉花的成熟纖維呈色進(jìn)行穩(wěn)定性分析,并分析了轉(zhuǎn)基因?qū)γ藁ù紊诤铣善?開(kāi)花后20天)纖維轉(zhuǎn)錄組的影響。同時(shí),對(duì)棉花的CCO基因家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析,利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS),沉默陸地棉組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的CCO基因,探究對(duì)棉花纖維呈色的影響,構(gòu)建CCO基因的RNA干擾載體,進(jìn)行棉花遺傳轉(zhuǎn)化。主要結(jié)果如下:1.Fbl2A::GhPSY2D棉花植株成熟纖維呈色分析對(duì)Fbl2A::GhPSY2D轉(zhuǎn)基因棉花的成熟纖維進(jìn)行表型觀察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于對(duì)照組,轉(zhuǎn)基因材料的成熟纖維呈現(xiàn)明顯的棕黃色。連續(xù)3個(gè)世代的觀察結(jié)果顯示,成熟纖維呈色能夠穩(wěn)定遺傳。2.Fbl2A::GhPSY2D棉花植株成熟纖維品質(zhì)分析對(duì)Fbl2A::GhPSY2D轉(zhuǎn)基因材料#210、#212號(hào)轉(zhuǎn)化子成熟纖維進(jìn)行衣分測(cè)定,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因材料衣分含量顯著下降;同時(shí),纖維品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示,Fbl2A::GhPSY2D成熟纖維馬克隆值顯著降低,分別為3.8±0.35和3.85±0.25,其余纖維品質(zhì)指標(biāo)無(wú)明顯變化。3.Fbl2A::GhPSY2D轉(zhuǎn)基因棉花#212轉(zhuǎn)化子20 DPA纖維轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)Fbl2A::GhPSY2D轉(zhuǎn)基因棉花開(kāi)花后20天的纖維進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,結(jié)果顯示,總共有8870個(gè)基因存在表達(dá)差異,其中有上調(diào)基因5336個(gè),下調(diào)基因3534個(gè)。進(jìn)一步對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析,上調(diào)差異表達(dá)的基因主要富集在α-亞麻酸代謝途徑、植物-病原體相互作用途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、苯丙氨酸代謝途徑、苯丙烷類(lèi)生物合成途徑、半胱氨酸和蛋氨酸代謝途徑和氨基糖和核苷酸糖代謝途徑。下調(diào)差異表達(dá)的基因主要富集在光合生物中的碳固定途徑、光合作用-天線(xiàn)蛋白途徑、乙醛酸和二羧酸代謝途徑、光合作用途徑、碳代謝途徑、植物晝夜節(jié)律途徑、油菜素內(nèi)酯生物合成途徑和磷酸戊糖途徑。4.棉花CCO基因家族成員的鑒定和進(jìn)化分析以擬南芥的CCO蛋白序列為參考,在雷蒙德氏棉、亞洲棉和陸地棉蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)CCO蛋白家族成員進(jìn)行鑒定,分別鑒定得到15、16和30個(gè)編碼CCO蛋白酶的基因。將擬南芥CCO基因家族成員與棉花CCO基因家族成員進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明,棉花CCO基因家族可以分為6簇,分別為CCD1、CCD4、CCD7、CCD8、CCD-like和NCEDs。5.CCO基因在陸地棉中的表達(dá)模式根據(jù)前人的野生型陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),對(duì)陸地棉CCO基因家族所有成員在各組織中的表達(dá)模式進(jìn)行Heatmap分析,結(jié)果顯示,與其它基因的表達(dá)水平相比,GhCCD1A/1D在陸地棉多數(shù)組織中優(yōu)勢(shì)表達(dá),此外,GhCCD4-2A在開(kāi)花后20天纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。同時(shí),選取陸地棉5個(gè)組織(根、莖、葉、花瓣以及20 DPA纖維),對(duì)GhCCOs基因進(jìn)行的qRT-PCR檢測(cè),與Heatmap結(jié)果相符合。6.沉默CCO基因提高棉花葉片與纖維中類(lèi)胡蘿卜素水平在白色棉花植株中利用VIGS技術(shù)沉默GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表達(dá),棉花子葉呈現(xiàn)明顯黃色,類(lèi)胡蘿卜素含量顯著提高。另外,以轉(zhuǎn)基因棉花Fbl2A::GhPSY2D為受體,利用VIGS技術(shù)下調(diào)GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表達(dá),沉默植株28DPA纖維顏色加深。7.CCO基因RNA干擾載體的構(gòu)建以及棉花遺傳轉(zhuǎn)化為了進(jìn)一步調(diào)控GhCCO基因的表達(dá),構(gòu)建了棉花遺傳表達(dá)載體pLGN-pFbl2A-GhCCDs-RNAi,并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。目前,獲得了轉(zhuǎn)基因幼苗3株。以上結(jié)果顯示,在棉花纖維次生壁合成時(shí)期特異上調(diào)基因GhPSY2D的表達(dá)水平,可以使棉花纖維呈現(xiàn)棕黃色,下調(diào)GhCCD1D和GhCCD4-2A基因的表達(dá),能進(jìn)一步加深棉花纖維的顏色。通過(guò)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素代謝基因表達(dá)水平的調(diào)控,改良彩色棉纖維的顏色。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：S562
【圖文】：

第 4 章 結(jié)果與分析第 4 章 結(jié)果與分析4.1 Fbl2A:: GhPSY2D 轉(zhuǎn)基因棉花纖維生化分析4.1.1 Fbl2A:: GhPSY2D 轉(zhuǎn)基因棉花的種植及鑒定從 Fbl2A:: GhPSY2D 轉(zhuǎn)基因棉花 T3 代中選取#210、#211、#212 三個(gè)表達(dá)量較高并且性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行種植作為 T4 代材料。通過(guò) PCR 擴(kuò)增和 qRT-PCR 檢測(cè)的方法對(duì)種植到田間的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行進(jìn)一步篩選，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因株系中 GhPSY2D 基因（20 DPA）的表達(dá)量明顯高于 null 系（圖 4.1）。由于 T4 代中#211植株較少，因此，選取#210 和#212 株系作為后續(xù)試驗(yàn)對(duì)象。

4.1.3 Fbl2A:: GhPSY2D 轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維衣分測(cè)定為了探究類(lèi)胡蘿卜素對(duì)棉花纖維品質(zhì)的影響，對(duì) T4 代材料進(jìn)行衣分測(cè)定，結(jié)果表明，相較于 null 系，#210 與#212 株系成熟纖維的纖維衣分含量顯著下降（圖4.3），#210 與#212 兩個(gè)株系的衣分分別為 24.33 %和 25.08 %，與 null 系（34.92 %）相比，分別下降了 10.59 %和 9.84 %。圖4.3成熟纖維衣分測(cè)定Figure 4.3 Determination of mature fiber lint percentage4.1.4 Fbl2A:: GhPSY2D 轉(zhuǎn)基因棉花成熟纖維品質(zhì)棉花纖維品質(zhì)指標(biāo)包括上半部平均長(zhǎng)度，整齊度指數(shù)，伸長(zhǎng)率，斷裂比強(qiáng)度和馬克隆值等。其中馬克隆值是反映棉花纖維細(xì)度與成熟度的綜合指標(biāo)，是棉纖維重要的內(nèi)在質(zhì)量指標(biāo)之一，與棉纖維的使用價(jià)值關(guān)系密切。2018 年 T4 代纖維品質(zhì)檢測(cè)結(jié)果顯示（表 4.2），與 null 系相比

西南大學(xué)碩士學(xué)位論文34圖4.5 Fbl2A::GhPSY2D#212轉(zhuǎn)化子和對(duì)照株系中部分上調(diào)的ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的qRT-PCR驗(yàn)證Figure 4.5 qRT-PCR verification of parts of ABA signal transduction pathway up-regulatedgenes in Fbl2A::GhPSY2D #212 transgenic line and control課題組前期研究表明，利用 SCFP 啟動(dòng)子在纖維伸長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá) GhOR 基因能夠在早期提高纖維中類(lèi)胡蘿卜素和伸長(zhǎng)期纖維中 ABA 的含量，同時(shí)能夠改變成熟纖維長(zhǎng)度、強(qiáng)度和細(xì)度等品質(zhì)指標(biāo)。同樣，在 Fbl2A：：GhPSY2D #212 轉(zhuǎn)化子20DPA 纖維與成熟纖維中也出現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果。因此，這種改變可能是通過(guò)調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素的含量，影響相關(guān)激素（ABA 等）合成來(lái)完成的。4.3 棉花 CCO 基因家族成員的鑒定和生物信息學(xué)分析課題組前期研究結(jié)果表明，為了徹底抑制纖維細(xì)胞中類(lèi)胡蘿卜素降解，除了抑制目標(biāo)類(lèi)胡蘿卜素下游的代謝基因外，還需進(jìn)一步抑制 CCO 基因的表達(dá)。同時(shí)

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本文編號(hào)：2751564