【摘要】：細(xì)葉石斛(Dendrobium hancockii Rolfe),是蘭科石斛屬(Dendrobium)多年生草本植物,不僅具有較高的藥用價(jià)值,能滋陰生津、潤肺明目,是加工成黃草藥材的主要來源之一,而且花姿玲瓏可愛,具有較高的觀賞價(jià)值。近年來細(xì)葉石斛因其具有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值而遭到采挖,再加上環(huán)境因素的制約,其資源大大減少。為保護(hù)利用這一藥材和滿足市場(chǎng)的需求,本論文開展了以下三個(gè)方面的研究:(1)細(xì)葉石斛組織培養(yǎng)體系的建立及生物反應(yīng)器的應(yīng)用。在本研究中,我們對(duì)細(xì)葉石斛種子萌發(fā)、原球莖增殖分化、生根壯苗各個(gè)階段的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,得出在種子萌發(fā)階段的最適培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/LNAA+1.5mg/L6-BA,并附加蔗糖30.0 g/L、瓊脂7.2 g/L;在原球莖增殖分化階段的最適培養(yǎng)基為:1/2MS+0.5 mg/LNAA+2.0 mg/L6-BA 并附加蔗糖 30.0 g/L、瓊脂 7.2 g/L、蛋白胨1 g/L;在壯苗生根階段最適培養(yǎng)基為:1/2MS+100 g/L馬鈴薯提取液+40.0 g/L香蕉提取液+1.5g/L蛋白胨,并附加蔗糖30.0g/L、瓊脂7.2g/L、活性炭1.5g/L。另外,我們還利用生物反應(yīng)器對(duì)細(xì)葉石斛進(jìn)行了組織培養(yǎng),發(fā)現(xiàn),在生物反應(yīng)器下培養(yǎng)的細(xì)葉石斛比在固體培養(yǎng)基中的細(xì)葉石斛生成的生物量顯著增加,而且植株更加健壯,根系更加發(fā)達(dá),解決了固體培養(yǎng)基中組培苗葉子發(fā)黃的現(xiàn)象。(2)細(xì)葉石斛葉綠體基因組的測(cè)序及分析。在本研究中,我們對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序、拼接、注釋及其結(jié)構(gòu)的分析,發(fā)現(xiàn),細(xì)葉石斛的葉綠體基因組大小為152,071 bp,是環(huán)形DNA雙鏈,分為四個(gè)結(jié)構(gòu)部分:一個(gè)大的單拷貝區(qū)(LSC),長度為85,004 bp;一個(gè)小的單拷貝區(qū)(SSC),長度為14,485 bp;兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)(IRA和IRB),長度為26,291 bp。GC含量為37.8%。細(xì)葉石斛葉綠體基因組中共有129個(gè)基因,19個(gè)重復(fù)基因位于重復(fù)區(qū),其中110個(gè)不重復(fù)基因中包含了 69個(gè)蛋白編碼基因,30個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA基因、4個(gè)核糖體RNA基因和7個(gè)假基因。并對(duì)細(xì)葉石斛與其他石斛屬植物的葉綠體基因組進(jìn)行了比對(duì),篩選出了變異度較高的序列,為后續(xù)的物種鑒定奠定了基礎(chǔ);此外,還對(duì)細(xì)葉石斛的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了研究,得出細(xì)葉石斛為石斛屬植物的基部類群;細(xì)葉石斛葉綠體基因組序列的獲得,對(duì)完善石斛屬葉綠體基因組信息,進(jìn)行石斛屬系統(tǒng)發(fā)育、物種鑒定的研究有較大的意義。(3)細(xì)葉石斛及其黃草制品的鑒定研究。在本研究中,我們建立了一種基于RTARMS-PCR技術(shù)快速鑒別細(xì)葉石斛及其黃草類藥材的方法,此技術(shù)將實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法與突變擴(kuò)增阻滯體系技術(shù)相結(jié)合,可以準(zhǔn)確、靈敏、方便地對(duì)細(xì)葉石斛及其47種黃草藥材的混淆品進(jìn)行鑒別。我們基于葉綠體基因組中變異度較高的片段設(shè)計(jì)了 ARMS特異性引物,并篩選出BT2-BT4、CP4-CP5、LU5-LU6這三對(duì)引物。此方法可以準(zhǔn)確有效、快速地將細(xì)葉石斛及其黃草類制品從混淆品中鑒定出來。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)細(xì)葉石斛進(jìn)行了組織培養(yǎng)體系的優(yōu)化,并運(yùn)用生物反應(yīng)器技術(shù)對(duì)細(xì)葉石斛進(jìn)行高效的繁殖;同時(shí),對(duì)細(xì)葉石斛的葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序、拼接和分析,為細(xì)葉石斛的系統(tǒng)進(jìn)化、物種親緣關(guān)系分析以及物種鑒定奠定了基礎(chǔ);并對(duì)細(xì)葉石斛加工生成的黃草藥材進(jìn)行鑒別,對(duì)規(guī)范市場(chǎng)上黃草藥材資源有一定的意義。
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S567.239
【圖文】：

逡逑取物４０．０邋ｇ／Ｌ＋蛋白胨１．５邋ｇ／Ｌ，由圖２．１也可以看出在此組合下（處理７）細(xì)葉石逡逑斛的株高最高為８．９４邋ｃｍ，且根長最長為７．６３邋ｃｍ，苗長勢(shì)較好，所以在生根壯苗逡逑階段的最適培養(yǎng)基為：１／２ＭＳ＋１００邋ｇ／Ｌ馬鈴薯提取液＋４０．０邋ｇ／Ｌ香蕉提取物＋１．５邋ｇ／Ｌ逡逑蛋白胨，并附加蔗糖３０．０ｇ／Ｌ、瓊脂７．２ｇ／Ｌ、活性炭１．５ｇ／Ｌ。逡逑表２．３．９邋Ｌ９（３４）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３．９邋Ｈｉｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｌ９（３４）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ邋ｔｅｓｔ逡逑因素（ｇ／Ｌ）逡逑處理編號(hào)邋邐株高（ｃｍ）邋根長（ｃｍ）逡逑ＡＢＣ逡逑１邐６０邐４０邐０．５邐６．４４邐４．３２逡逑２邐６０邐６０邐１，０邐６．５９邐３．２１逡逑３邐６

而固體培養(yǎng)下的莖直徑為２．５２邋ｍｍ，說明反應(yīng)器培養(yǎng)下的細(xì)葉石斛苗較為粗壯；逡逑在根長方面，固體培養(yǎng)下的根長較長，反應(yīng)器培養(yǎng)下的根稍短，但根的數(shù)量較多。逡逑圖２．３表示在反應(yīng)器培養(yǎng)下和固體培養(yǎng)下的兩種培養(yǎng)模式組培苗的生長情況，Ａ、逡逑Ｂ兩張圖片是指在反應(yīng)器中的生長狀況，Ｃ、Ｄ是指在組培瓶固體培養(yǎng)基中的生逡逑長情況，可以看出，在反應(yīng)器培養(yǎng)條件下的細(xì)葉石解苗長勢(shì)較好，沒有干枯黃葉逡逑出現(xiàn)，單株?duì)顟B(tài)下莖桿較為粗壯，根數(shù)較多；在固體培養(yǎng)瓶里的細(xì)葉石斛苗有黃逡逑葉出現(xiàn)，且單株?duì)顟B(tài)下根較長，數(shù)目較少。逡逑表２．３．１４培養(yǎng)方式對(duì)組培苗外觀狀態(tài)影響逡逑Ｔａｂｌｅ邋２．３．１４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｔｈｏｄｓ邋ｏｎ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ａｐｐｅａｒａｎｃｅ邋ｗｉｔｈｉｎ邋ｐｌａｎｔｌｅｔｓ逡逑每個(gè)容器中測(cè)得的量逡逑培養(yǎng)方式邋邐逡逑株高（ｃｍ）邐儢直徑（ｍｍ）邐根長（ｃｍ）逡逑固體邐８．６７±０．２８ａ邐２．５２±０．３６ｂ邐６．７２±０．２６ａ逡逑反應(yīng)器邐８．７３±０．３３ａ邐３．７１邋土０．４２邋ａ邐５．５７±０．１８ｂ逡逑Ｈｉｍ逡逑圖２．３不同的培養(yǎng)方式下得到的細(xì)葉石斛組培苗逡逑Ａ、Ｂ—反應(yīng)器培養(yǎng)；Ｃ、Ｄ—固體培養(yǎng)逡逑Ｆｉｇ邋２．３邋Ｔｗｏ邋ｓｐｅｃｉｅｓ邋ｏｆ邋Ｄｅｎｄｒｏｂｉａｍ邋ｈａｎｃｏｃｋｉｉ邋Ｒｏｌｆｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ逡逑Ａ、Ｂ：邋Ｒｅａｃｔｏｒ

邐、玫瑰石斛（Ｄ．邋ｃｒｅｐ／ｉｔｏｗｍ）、杯鞘石斛逡逑（Ｄ．邋ｇｒａ／ｚＷｗ／ｍ佭）、重唇石斛（Ｄ．邐妙《？？■）、美花石解（Ｄ．邋／0而／職說）、逡逑流蘇石解咖／ｆｌ／ｗｗ）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析（圖３．４）發(fā)現(xiàn)：細(xì)葉石斛獨(dú)自聚逡逑為一支，位于系統(tǒng)進(jìn)化的基部位置。逡逑邐Ｄ．邋ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ逡逑９８逡逑１00邐邋Ｄ．邐ｈｅｒｃｏｇｌｏｓｓｕｍ逡逑１００邐邋Ｄ．邐ｎｏｂｉｌｅ逡逑邐—邐Ｄ．邐ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ逡逑邐邐Ｄ．邐ｄｅｖｏｎｉａｎｕｍ逡逑９２邐Ｄ．邐ｇｒａｔｉｏｓｉｓｓｉｍｕｍ逡逑邐Ｄ．邐ｃｒｅｐｉｄａｔｕｍ逡逑邐９５邐邐９０＿逡逑邐Ｄ．邐ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ逡逑９６逡逑邐邋邋Ｄ．邐ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ逡逑邐邋邋Ｄ．邐ｈａｎｃｏｃｋｉｉ逡逑邐—邐邋邋Ｐ．邐ａｐｈｒｏｄｉｔｅ逡逑圖３．４基于葉綠體全基因組的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．４邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｏｍｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｗｈｏｌｅ邋ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ邋ｇｅｎｅｓ逡逑３．４討論逡逑在本章的研宄中，我們對(duì)細(xì)葉石斛的葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序、注釋和分析，逡逑發(fā)現(xiàn)，細(xì)葉石斛的葉綠體基因組大小為］５２，０７］ｂｐ，與已經(jīng)測(cè)得的齒瓣石斛、金逡逑釵石斛、杯鞘石斛等的葉綠體基因組大小差別并不是很大，表明了葉綠體基因組逡逑較為保守。且都是環(huán)形ＤＮＡ雙鏈，分為四個(gè)結(jié)構(gòu)部分，大的單拷貝區(qū)（ＬＳＣ），逡逑長度為８５，００４邋ｂｐ；小的單拷貝區(qū)（ＳＳＣ），長度為１４，４８５邋ｂｐ；兩個(gè)反向重復(fù)區(qū)逡逑（ＩＲＡ和ＩＲＢ）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2750709