【摘要】：馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)作為世界第四大糧食作物,因其營養(yǎng)價值高、適應(yīng)性強及高產(chǎn)等性狀,對保證世界尤其是發(fā)展中國家的糧食產(chǎn)量及安全有著重要的作用。然而,由于馬鈴薯結(jié)薯對光周期敏感性,導(dǎo)致很多馬鈴薯優(yōu)良品種無法適應(yīng)長日照生長條件,造成了生產(chǎn)上的局限性。因此,光周期介導(dǎo)的馬鈴薯塊莖形成機制研究,對馬鈴薯生產(chǎn)具有重要的應(yīng)用及理論指導(dǎo)意義。前人對馬鈴薯光周期介導(dǎo)的塊莖形成機制已經(jīng)有較多研究,包括以StCOL1為中心的基因調(diào)控。目前認(rèn)為,StCOL1通過結(jié)合到StSP5G的啟動子上激活StSP5G的表達(dá),進而抑制StSP6A的表達(dá)從而抑制馬鈴薯在長日照條件下結(jié)薯,而光敏色素StPHYB則通過穩(wěn)定StCOL1蛋白參與抑制馬鈴薯在長日照條件下結(jié)薯。本實驗室前期通過分別干涉馬鈴薯中5個光敏色素基因(StPHYA、StPHYB、StPHYB2、StPHYE和StPHYF)發(fā)現(xiàn),干涉StPHYF能夠促進馬鈴薯試管薯的形成。在此基礎(chǔ)上,本課題對光敏色素F介導(dǎo)的塊莖形成機理進行了進一步研究,主要結(jié)果如下:1.干涉光敏色素StPHYF和StPHYB基因均能夠解除長日照對塊莖形成的抑制。以實驗室前期獲得的分別干涉5個光敏色素基因的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系為材料,檢測了其試管薯形成表型及相關(guān)基因的表達(dá),結(jié)果證明,在組織培養(yǎng)(異養(yǎng))條件下,StPHYB和StPHYF的干涉株系都能夠在長日照條件下形成試管薯,其它3個光敏色素基因的干涉株系在長日照條件下則不能形成試管薯,且干涉任何一個光敏色素基因?qū)ζ渌饷羯鼗虻谋磉_(dá)沒有影響。由于前期獲得的轉(zhuǎn)基因干涉株系的受體基因型為鄂馬鈴薯3號(E3),試管薯形成對光周期敏感,但在自然生長條件下結(jié)薯對光周期并不敏感,因此無法驗證StPHYF在長日照條件下是否能夠抑制馬鈴薯塊莖的形成。為此,我們以一個光周期敏感基因型E109_(sm)(E109)為受體進行轉(zhuǎn)化,獲得了StPHYF的轉(zhuǎn)基因干涉株系StPHYFi-E109,并對其在長短日照條件下的異養(yǎng)和自養(yǎng)條件下的結(jié)薯表型進行了觀察。結(jié)果顯示,野生型E109長日照自養(yǎng)及異養(yǎng)兩種培養(yǎng)條件下均不能結(jié)薯。而干涉株系StPHYFi-E109在長日照自養(yǎng)及異養(yǎng)條件下均能結(jié)薯。該結(jié)果明確顯示,StPHYF基因具有在長日照條件下抑制馬鈴薯塊莖形成的功能。進一步通過qRT-PCR檢測StPHYFi-E109干涉株系中各光敏色素表達(dá)量時發(fā)現(xiàn),干涉StPHYF基因沒有影響馬鈴薯其它光敏色素基因的表達(dá)。本研究首次證明StPHYF在光周期誘導(dǎo)的馬鈴薯塊莖形成中具有重要作用。2.StPHYF與StPHYB互作形成異源二聚體。研究首先采用農(nóng)桿菌注射煙草葉片瞬時表達(dá)系統(tǒng)進行了StPHYF及StPHYB的亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示StPHYF及StPHYB均定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。之后利用酵母雙雜、BiFC、Co-IP等三種方法進行系統(tǒng)的蛋白質(zhì)互作研究。結(jié)果表明,馬鈴薯StPHYF和StPHYB在體內(nèi)外均能夠互作形成異源二聚體。通過將StPHYF和StPHYB分別截短成N端和C端,對二者互作結(jié)構(gòu)域的驗證結(jié)果證明,二者通過StPHYF的C端與StPHYB的N端互作形成異源二聚體。這些結(jié)果表明,StPHYF和StPHYB可能通過形成異源二聚體對馬鈴薯塊莖形成的光周期敏感性進行調(diào)控。3.StPHYF和StPHYB均涉及調(diào)控StCOL1蛋白穩(wěn)定性進而影響塊莖形成。研究制備了馬鈴薯StCOL1蛋白的特異性抗體,通過Western blot檢測轉(zhuǎn)基因干涉株系及其對照非轉(zhuǎn)基因株系中StCOL1蛋白的相對含量,結(jié)果顯示,干涉StPHYF和StPHYB轉(zhuǎn)基因株系的StCOL1蛋白含量均顯著低于對照,由此說明StPHYF和StPHYB均能介導(dǎo)調(diào)控StCOL1蛋白的穩(wěn)定性,也暗示StPHYF和StPHYB可能通過穩(wěn)定StCOL1蛋白實現(xiàn)對長日照結(jié)薯的抑制。4.干涉StPHYB和StPHYF基因影響了CO-FT途徑關(guān)鍵基因StSP5G和StSP6A的表達(dá)。前人研究表明,馬鈴薯StCOL1和StSP5G是塊莖形成的抑制因子,而StSP6A和StCDF1是誘導(dǎo)塊莖形成的因子,本研究對StPHYF及StPHYB干涉株系中這4個基因的表達(dá)進行了檢測。結(jié)果表明,在E3和E109兩個受體基因型的轉(zhuǎn)基因干涉株系中,StSP5G的表達(dá)顯著下降,而StSP6A的表達(dá)則顯著升高,證明StPHYF和StPHYB對馬鈴薯塊莖形成的調(diào)控確實處于StSP5G和StSP6A的調(diào)控鏈上。但StCOL1表達(dá)量并未發(fā)生改變的結(jié)果進一步表明,StPHYF和StPHYB對StCOL1的調(diào)控不是在基因轉(zhuǎn)錄水平上。轉(zhuǎn)基因株系StCDF1基因在葉片中的表達(dá)水平與對照沒有顯著差異,但匍匐莖中的表達(dá)卻顯著升高,這一結(jié)果暗示StPHYF可能并未參與調(diào)控StCDF1在葉片中的表達(dá),卻可能參與調(diào)控了StCDF1在匍匐莖中的表達(dá)。5.StPHYF介導(dǎo)了塊莖形成相關(guān)的信號長距離運輸。本研究將轉(zhuǎn)基因干涉株系StPHYFi-E109作為接穗,嫁接到非轉(zhuǎn)基因株系E109砧木上,在長日照條件下生長,結(jié)果顯示,StPHYFi-E109接穗可以誘導(dǎo)E109砧木的匍匐莖結(jié)薯,而當(dāng)以E109作為接穗,StPHYFi-E109轉(zhuǎn)基因干涉株系PHYFi-E109-14作為砧木時,PHYFi-E109-14砧木的匍匐莖則無法形成塊莖。由此表明,地下匍匐莖能否膨大形成塊莖是由地上部的某種信號決定的,而StPHYF介導(dǎo)了與此相關(guān)的信號由地上部向地下部的傳遞。同時,研究采用qRT-PCR檢測了地上部葉片及地下部匍匐莖中塊莖形成途徑相關(guān)基因的表達(dá),同樣顯示當(dāng)接穗為PHYFi-E109-14時,匍匐莖中的StCDF1和StSP6A的表達(dá)顯著升高。這一結(jié)果還暗示,可能還存在另一個信號因子隨StSP6A共同從葉片傳遞到匍匐莖中調(diào)控了StCDF1的表達(dá),與StSP6A一起雙重保障調(diào)控塊莖的形成。6.篩選鑒定了StPHYF和StPHYB的互作蛋白及StPHYF調(diào)控的下游基因。實驗采用馬鈴薯塊莖形成光周期敏感性不同的基因型E20、E26和E108為材料,構(gòu)建了用于酵母雙雜的cDNA文庫以篩選互作蛋白。結(jié)果顯示,全長BK-StPHYF獲得28個潛在互作蛋白,StPHYF的C端BK-StPHYF~C為獲得48個潛在互作蛋白,StPHYF的N端BK-StPHYF~N獲得22個潛在互作蛋白,去除重疊的蛋白,共篩選到79個潛在互作蛋白。StPHYB的N端BK-StPHYB~N獲得11個潛在互作蛋白,其中有8個互作蛋白同時出現(xiàn)在StPHYF篩到的互作蛋白中,僅3個為StPHYB~N特有的互作蛋白。其中,與StPHYF互作的bHLH、Zinc finger和NAC轉(zhuǎn)錄因子及兩個激酶可能在StPHYF的功能調(diào)控中具有重要作用,互作的激酶可能涉及到光敏色素或相關(guān)蛋白質(zhì)的磷酸化。同時以E109(PHYFi-E109-13和PHYFi-E109-14)和E3(PHYFi-E3-9和PHYFi-E3-15)轉(zhuǎn)基因干涉株系為材料,采用RNA-seq分析篩選長日照條件下的差異表達(dá)基因,共篩選獲得了32個可能受到StPHYF調(diào)控的差異表達(dá)基因,其中MADS轉(zhuǎn)錄因子可能與塊莖形成調(diào)控有關(guān),萜烯合成相關(guān)基因可能與長距離信號傳輸有關(guān)。這些結(jié)果為后續(xù)研究提供了新的思路與方向。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S532
【圖文】：

有了詳細(xì)的研究（圖 1）。其中干涉 StSUT鈴薯葉片的糖流出，改變馬鈴薯塊莖的糖積T1 的反義 RNA 的轉(zhuǎn)基因株系在塊莖形成部組織沒有影響（Kühn et al 2003）。有研應(yīng)答，說明蔗糖在植物生長發(fā)育中還扮演97）。

2：陽光光譜分布及各光受體接受的光信號的波長分布（Kami et al 201pectral photon distribution of sunlight and the impact of different wavebastatus of phytochromes, cryptochromes, phototropins, and UVR8.

圖 2：陽光光譜分布及各光受體接受的光信號的波長分布（Kami et al 2010a Spectral photon distribution of sunlight and the impact of different wavebandstatus of phytochromes, cryptochromes, phototropins, and UVR8.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 常宏;王玉萍;王蒂;張峰;;光質(zhì)對馬鈴薯試管薯形成的影響[J];應(yīng)用生態(tài)學(xué)報;2009年08期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 沈云龍;馬鈴薯薯形相關(guān)基因序列分析及光敏色素影響塊莖形成初步研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2749254