【摘要】：植物microRNA(mi RNA)是近年來被廣泛研究的一類長度約為20~24 nt的內(nèi)源非編碼小RNA(small non-coding RNA),在動植物基因表達的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。它是由RNA聚合酶II(Pol-II)轉(zhuǎn)錄而來的初級轉(zhuǎn)錄本(primary-miRNA,pri-mi RNA)經(jīng)核糖核酸酶DCL1(DICER-LIKE 1)加工后的miRNA/miRNA*雙鏈聚合體而來。成熟miRNA可進一步與Argonaute(AGO)蛋白等結(jié)合形成RISC復(fù)合體(RNA-induced silencing complex)來切割靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻譯,從而實現(xiàn)對靶基因表達的負調(diào)控。miRNA可與靶基因mRNA互補配對結(jié)合,通過切割靶基因mRNA或抑制其翻譯的方式,在轉(zhuǎn)錄后水平上實現(xiàn)對靶基因表達的調(diào)控,進而對植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成、代謝以及逆境響應(yīng)等多個方面產(chǎn)生重要的影響。目前,在玉米、水稻、大豆、棉花、番茄、白菜、黃瓜等重要糧食作物和蔬菜中均發(fā)現(xiàn)大量miRNA的存在,這些miRNA很大程度上影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。如水稻中干擾miRNA對靶基因的調(diào)控,優(yōu)化了水稻的株型,使得水稻分蘗數(shù)降低,增加了水稻的抗倒伏能力,并提高了水稻的產(chǎn)量;也可通過調(diào)控獨角金內(nèi)酯(strigolactone,SL)信號途徑,來影響水稻的分蘗及產(chǎn)量;miRNA過表達使稻穗枝梗數(shù)目增多、稻粒增大。這意味著miRNA在改良農(nóng)作物性狀、開發(fā)具有優(yōu)良品質(zhì)的新品種中具有重大的應(yīng)用價值和發(fā)展?jié)摿Α１狙芯恳运?Oryza sativa cv Nipponbare)為材料,構(gòu)建了水稻miR159家族六個成員、和miR390及其13個靶基因的CRISPR/Cas9和過表達載體,轉(zhuǎn)化水稻以研究miR159及miR390在水稻生長發(fā)育中的功能。結(jié)果如下:(1)以CRISPR/Cas9技術(shù)對水稻miR390成熟序列進行定點突變,在T_0代即獲得了突變植株,突變類型包括了編輯位點處單堿基A的缺失或插入、T替換成A、三個堿基GCT及六個堿基AGCTCA的缺失等情況,復(fù)繁突變株系至T_2代即獲得了不含CRISPR/Cas9的單堿基(A變T)純合突變體,該水稻突變株系具有分蘗數(shù)增多、種子變長等表型。(2)miR390及其靶基因的時空表達:野生型水稻熒光定量PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR390在水稻的地上部分表達量高,同時在開花階段miR390與靶基因TAS3b1、06g03970表達量呈現(xiàn)上升的趨勢,但ARFs的表達量很低,mi R390是否通過靶基因來調(diào)控分蘗數(shù)和種子的發(fā)育過程,具體的調(diào)控機制還有待進一步深入研究。(3)miR159的時空表達:miR159基因在成熟階段的表達是最高的,miR159f從萌芽期到成熟期無論是在地上部分還是地下部分其表達量都呈現(xiàn)上升的趨勢在成熟期表達量最高,從孕穗時期來看,miR159a/b/c/d/f早期的表達量是最高的,但miR159e在孕穗期基本不表達。從開花時期來看,miR159c/d的表達從開花當天到開花第六天表達量減少,后期表達增多。將CRISPR/Cas9技術(shù)引入水稻mi RNA的研究,可獲得一系列水稻的miRNA突變體,豐富水稻的種質(zhì)資源,可為水稻的遺傳改良及新品種選育開辟新的途徑;CRISPR后期可通過雜交去除轉(zhuǎn)基因,獲得不含轉(zhuǎn)基因成分但基因得到編輯并可穩(wěn)定遺傳的植株,這種非轉(zhuǎn)基因作物不存在轉(zhuǎn)基因安全隱患,易于被社會接受得到快速推廣應(yīng)用。
【圖文】：

miR159 和 miR390 在水稻生長發(fā)育中調(diào)控功能的初探生物合成是以 Pol-II 作用下 miRNA 基因轉(zhuǎn)錄形成 pri-miRNA 開始，隨后pri-miRNA 折疊成一個特定的二級莖環(huán)(stem-loop)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該發(fā)夾結(jié)構(gòu)可被具有核糖核酸酶活性的 DCL1 家族成員等形成的蛋白切割復(fù)合體(dicing body)識別并裂解形成 70~350 nt 的莖環(huán)狀前體(precusor miRNA，pre-miRNA)，并在 HYL1(HYPONASTIC LEAVES1) 和 SE (SERRATE) 的 作 用 下 被 進 一 步 加 工 成miRNA/miRNA*復(fù)合體，該二聚體隨后經(jīng) HEN1 (HUA ENHANCER1)甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化修飾并在 HST (HASTY)蛋白作用下出核，成熟 miRNA 與 AGO 蛋白可結(jié)合形成 RISC 復(fù)合體調(diào)控靶基因的表達[3]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，，CBP20(CAP-BINDING PROTEIN20)和 CBP80 (CAP-BINDING PROTEIN80)在 miRNA合成過程中發(fā)揮著與 SE 和 HYL1 類似的功能，同時剪接因子 RS40 和 RS41 以及 RNA 結(jié)合蛋白 HOS5 也直接參與 miRNA 的合成，并且 RNA 結(jié)合蛋白 SE 和HYL1 與 DCL 之間的互作是調(diào)控 pri-miRNA 加工的重要機制[3-5]。

圖 2 pCAMBIA1390-OsNLSCas9-miR159/390 sgRNA 載體的構(gòu)建1. miR159 和 miR390 靶位點的選擇和引物設(shè)計首先在 miRbase（http://www.mirbase.org/）中查找水稻 miR159 和 miR390 的前體及成熟序列，利用 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 BLAST 程序確定水稻前體及成熟 miR159 和 miR390 所在的基因組序列，然后通過 CRISPR-p程 序 (http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) ， 以 Oryza sativa L. japonnica cv.Nipponbare 的基因組序列為參考基因組設(shè)計 miR159 和 miR390 的 sgRNA 靶位點。對得到的多個 sgRNA 序列根據(jù)以下原則選取：a)sgRNA 位點位于成熟miR390 序列；b)具有較高的評分(Score)；c)具有較少的目的基因外靶點。最終確定靶位點及其對應(yīng)的 PAM 序列，并設(shè)計引物用于 sgRNA 的組裝（表 6）。2. miR159 和 miR390 靶基因的靶位點的選擇和引物設(shè)計
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S511

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;水稻花粉的鏡檢[J];科技簡報;1973年15期

本文編號：2707659