【摘要】：天麻(Gastrodia elata Bl.)作為一種食藥同源的植物,既有改善心腦血管功能、抗衰老、抗癌等藥用價值,又有補(bǔ)充微量元素和氨基酸的營養(yǎng)價值,是我國重要的中藥材,其國內(nèi)外需求量較大,所以在市場上一直存在供不應(yīng)求的狀況。而天麻是蘭科植物中高度退化,無法靠自身營養(yǎng)萌發(fā),在生活史的后期也沒有可以用來吸收外界營養(yǎng)的根,所以在萌發(fā)菌的幫助下才能完成其種子的萌發(fā),之后的正常生長則需與蜜環(huán)菌共生。萌發(fā)菌和蜜環(huán)菌在天麻的生長過程中起著決定性的作用,兩菌協(xié)同促進(jìn)其萌發(fā)和生長。目前在天麻的種植中,兩菌退化、易污染等問題限制著天麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,而對于本文重點研究的對象天麻萌發(fā)菌小菇屬(Mycena)真菌來說還存在著菌種混亂、分離困難、菌株難以鑒定、萌發(fā)菌培養(yǎng)期長等問題。為了解決以上問題,本課題進(jìn)行高通量測序、小菇屬特異性引物設(shè)計、培養(yǎng)基優(yōu)化和真菌分離四項研究,得到了以下結(jié)論:1、通過高通量測序探明了天麻萌發(fā)初期三個階段與其生活土壤的菌群存在一定的差異。四組樣本有239個OTUs存在差異,其中有16個屬共同存在于四組樣本,原球莖菌群結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,只分布于原球莖的有8個屬,共同存在于原球莖和米麻的有7個屬,而同時存在于三個階段組織的菌株僅有1個。小菇屬真菌在所測樣本中分布很少,在各組的分布比例隨天麻原球莖的生長減少,在原球莖樣本占到1.5%的比例,在米麻樣本占到0.05%的比例,在土壤樣本中存在極其微量,而在白頭麻樣本中未檢測到,所以分離時需要大量的分離材料且需要對分離材料有所選擇。這些結(jié)論為下一步有針對性的尋找分離材料奠定了基礎(chǔ)。2、設(shè)計了5對小菇屬特異性引物,對它們的特異性、靈敏度和實際運(yùn)用能力進(jìn)行了評估。其中,特異性較好的四對引物分別為M52-2、M22-3、M11-4、BZ-5,在來自三個門、45個科的125個測試菌株范圍內(nèi)能測出的菌株數(shù)量分別為2.4%、6.4%、4.0%和7.2%;靈敏度較好的M22-3和BZ-5能檢測到菌絲在土壤中的最小濃度均為0.033%;實際用總DNA檢測后顯示M22-3和BZ-5能夠從樣本總DNA中檢測出小菇屬真菌。特異性引物的設(shè)計為菌種的鑒定提供了一種快速而又簡便方法,可以改善菌株難以鑒定、菌種混亂的問題。3、采用均勻設(shè)計對小菇一級種的合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計,并采用二次多項式逐步回歸對合成培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化,得到了能使小菇快速生長的培養(yǎng)基配方。合成培養(yǎng)基培養(yǎng)小菇21天后,直徑優(yōu)化配方得到直徑為69.0cm,生物量優(yōu)化配方得到生物量為0.2685g;而天然培養(yǎng)基均勻設(shè)計配方培養(yǎng)15天的后,直徑最大的配方得到直徑為74.7cm,生物量最大的配方得到生物量為0.3653g。探討對小菇生長影響較大的幾種營養(yǎng)因子之間的交互作用,顯著影響小菇菌落直徑的因子主要為甘氨酸、磷酸二氫鉀、可溶性淀粉、酵母膏和蛋白胨,其中磷酸二氫鉀與可溶性淀粉、酵母膏與蛋白胨,兩組營養(yǎng)元素有強(qiáng)烈的交互作用;影響小菇菌落生物量的因子主要為甘露醇、七水硫酸鎂、蔗糖、甘氨酸和蛋白胨,其中蔗糖與甘露醇、蔗糖與甘氨酸、七水硫酸鎂與蛋白胨、七水硫酸鎂與甘露醇,四組營養(yǎng)元素有強(qiáng)烈的交互作用。培養(yǎng)基的優(yōu)化為研究小菇發(fā)菌期培養(yǎng)基提供了一定的理論基礎(chǔ)。4、最后對采集樣本進(jìn)行了內(nèi)生菌分離,得到259株真菌,進(jìn)行形態(tài)合并、選擇后測序得到65個OTUs,這些菌株來自3個門39個科,其中Ascomycota(93.2%)和Basidiomycota(6%)占比最大,Mucoromycota占比在1%以下。在真菌分離中得到了一些高通量測序中注釋到的真菌,分別為Mariannaea(3.0%)、Trichoderma(8.3%)、Clonostachys(4.5%)、Fusarium(15.8%)屬的真菌,推測它們可能是一些潛在的萌發(fā)菌株,后期可進(jìn)行萌發(fā)試驗來驗證�？傊�,通過以上研究我們期望可以縮短小菇的生長時間,解決萌發(fā)菌發(fā)菌期長的問題,并且為快速定位、分離小菇奠定基礎(chǔ),推動未來天麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
【圖文】：

天麻生活史Fig.1-1ThelifecyleofG.elataBl.

采樣環(huán)境Fig.2-1Samplingenvironment
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2707128