【摘要】：紅花(Carthamin tictorius L.)是一種具有活血通經,散瘀止痛之功效的傳統(tǒng)藥用植物,入藥部位為其干燥管狀花�，F代藥理研究表明,它具有抗血栓、抗氧化、抗炎、抗過敏等作用,其主要的藥效成分為黃酮醇類化合物(如山萘酚及其苷類,槲皮素及其苷類)以及特異性查爾酮化合物(如羥基紅花黃色素A、Carthamin等)。迄今為止,模式植物中黃酮的生物合成途徑已有很多的研究,普遍認為,其源于苯丙氨酸途徑,通過查爾酮合成酶這一橋梁啟動黃酮類成分的生物合成。但是關于紅花中黃酮的生物合成途徑,尤其是特有的活性查爾酮成分生物合成途徑研究仍鮮有報道�；诒菊n題組前期構建的紅花花冠轉錄組數據庫以及Y品系(黃色花,富含HSYA)和W品系(白色花,不含HSYA)時序性差異表達圖譜,我們篩選出在Y品系特異性高表達的266個差異基因,其中包含了參與紅花生物合成途徑的重要結構基因:查爾酮合成酶基因CHS、查爾酮異構酶基因CHI、黃酮苷末端修飾酶UGT和轉錄調控因子MYB等多個基因。首先,借助RACE克隆技術拼接出差異基因(CtCHS1、Ct CHI1、UGT)和轉錄因子(CtMyb13)全長。氨基酸序列同源性比對和系統(tǒng)進化樹分析顯示CtCHS1與其他家族的查爾酮合成酶具有87%的氨基酸相似度,CtCHI1與來自Saussurea medusa的CHI有高達92%的氨基酸相似度,后者的過表達可以顯著提高水母雪蓮毛狀根中的芹菜素含量。為了驗證基因的體外功能,我們運用異源表達技術,分離純化出基因編碼蛋白酶CtCHS1和CtCHI1,并對酶體外活性進行底物篩選和催化參數檢測。體外實驗結果表明CtCHS1具有典型的CHS活性,即催化3個丙二酰輔酶A和1個香豆酰輔酶A生成柚皮素,CtCHI1可以催化2,,4,,4,6,-羥基查爾酮異構化為柚皮素,從而證明CtCHS1和CtCHI1均是具有活性的催化蛋白酶。為了分析基因在植物體內的定位特征,將構建的重組瞬時表達載體pMT39-CtCHS1和pMT39-CtCHI1通過農桿菌GV3101介導侵染擬南芥原生質體和煙草進行瞬時表達,亞細胞定位分析結果顯示pMT39-CtCHS1定位在細胞質,pMT39-CtCHI1定位在細胞核。構建35S啟動的真核重組載體并融合GFP標簽,通過花粉管通道法轉化紅花Y品系,實現紅花植株水平的基因工程操作和新基因在蛋白水平的檢測。和空載組比較,在mRNA水平上,過表達CtCHS1可以激活上游基因PAL2,PAL3,4CL2,CHS4和CHS6的表達,同時抑制4CL1,4CL3,4CL5,CHI2和DFR1的表達。在代謝水平上,CtCHS1過表達可以促使醌式查爾酮化合物HSYA和Carthamin分別上調19.83%和29.48%,黃酮醇類化合物呈現出與之完全相反的趨勢,均呈現不同程度的下調,槲皮素,槲皮素-3-O-葡萄糖苷下調高達50~60%,山萘酚和蘆丁也分別下降14.41%和24.89%,山萘酚-3-O-β-D葡萄糖苷下調17.06%,D-Phenylalanine下調39.51%。由此推測,CtCHS1可能參與正向調節(jié)醌式查爾酮化合物分支的含量積累,并抑制黃酮醇類分支化合物的生成。利用葉盤轉化法我們獲得了CtCHI1過表達煙草植株,CtCHI1過表達促進了上游基因NtC4H和Nt4CL表達。HPLC結果顯示花青素苷元下降高達64.55%,槲皮素苷元在下降高達70%,山萘酚苷元則顯著增加10%~20%。由此可以看出CtCHI1的過表達在煙草中對代謝產物的積累起了分流作用。在轉基因紅花中,CtCHI1過表達可以促進上游基因CtPAL3,CtC4H1和CtCHS1分別增長3.88,2.12和3.03倍,抑制下游基因CtF3H和CtDFR2的表達。為了評價CtCHI1過表達對轉基因紅花代謝組的影響,我們對轉基因組和未轉基因組的紅花進行了PCA和PLS-DA分析,通過PCA分析,我們發(fā)現轉基因組和未轉基因組代謝組主成分可以得到有效分離。另外,監(jiān)督PLS-DA在負離子模式下能得到很好的響應,可以分離出788差異性代謝產物。對次生代謝物進行UPLC-QTOF/MS定量分析表明,CtCHI1過表達可以顯著提高HSYA和山萘酚-3-O-蕓香糖苷,二氫山萘酚和蘆丁的含量。在紅花轉錄組數據庫中,共有27個糖基轉移酶UGT基因全長,基于時序性表達圖譜分析,我們篩選出在兩個品系的生長發(fā)育過程中具有顯著差異的CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25。系統(tǒng)進化樹分析顯示CtUGT3和CtUGT16歸類到廣泛參與植物體內代謝進程的UGT71亞家族中。Ct UGT25與PoUGT具有很高的序列相似度,隸屬于UGT90亞家族,主要參與黃酮類化合物的糖基化修飾。將CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25與已經報道的10個黃酮糖基轉移酶基因進行多序列比對,結果顯示這三個UGT基因與黃酮糖基轉移酶基因具有很高的同源性。由此可以預見,CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能也具有參與紅花體內黃酮類化合物的糖基化修飾功能。運用WOLF PSORT亞細胞定位預測,我們發(fā)現CtUGT3和CtUGT16可能主要位于細胞質,CtUGT25可能主要位于葉綠體。Signal P4.1 Server分析證實這三個蛋白均沒有信號肽。這些結果顯示CtUGT3,CtUGT16和CtUGT25可能不具有蛋白轉運功能,主要在細胞質和葉綠體中發(fā)揮蛋白酶催化功能。通過MeJA誘導實驗,我們構建了“基因-化合物”在紅花兩個不同品系中時序性表達相關網絡,結果表明CtUGT3和CtUGT25在Y品系紅花中主要誘導山萘酚-3-O-葡萄糖苷黃酮醇的積累,在W品系中促進槲皮素-3-O-葡萄糖苷黃酮醇的生成,CtUGT16則廣泛參與兩個紅花品系中槲皮素-3-O-葡萄糖苷的正向調控。另外,我們首次對紅花MYB家族進行了系統(tǒng)的生物信息學分析,從轉錄祖數據庫中共篩選出21個R2R3-MYB,利用multiple em for motif elicitation(MEME)和Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)分析R2R3-MYB中10個motif所在位置及功能,結果顯示motif 3和motif 6是保守DNA結合域,其他motif多為未知功能結構域。通過基因芯片和化合物時序性表達相關性分析發(fā)現,R2R3-MYB轉錄因子MYB13,MYB14與HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的積累呈正相關關系("#r"#≥0.7),且MYB13與MYB14序列高度相似,在進化上具有近源關系。為了研究MYB調控的分子機制,我們構建了紅花花冠次級酵母文庫,通過Y2H共轉法篩選出了與MYB13互作的7個蛋白:CtSDGL,CtEPGL,CtPHOX1L,CtB2L,CtASC1,CtMPL1,CtMPL2。更深入的研究正在進行中。綜上所述,過表達CtCHS1和CtCHI1可以正反饋調控上游基因PAL,CHS的表達,并促進紅花中醌式查爾酮類化合物的積累;但抑制了下游基因表達。Ct UGT3,CtUGT16和CtUGT25廣泛參與紅花體內黃酮醇類化合物的糖基化修飾。R2R3-MYB轉錄因子MYB13可能正向調控HSYA和山萘酚-3-O-葡萄糖苷的積累。本研究結果為闡明紅花黃酮類成分的生物合成途徑提供了重要科學依據。
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圖 1.1 兩種紅花品系(ZHH0119 和 XHH007)及其不同發(fā)育期縱切面和花瓣狀態(tài)a,b,c: 紅花 ZHH0119 品系特征圖;d, e, f: 紅花 XHH007 品系特征圖; a,d:花序;b,e:界定的兩個品系四個發(fā)育期縱切面;c, f：界定的兩個品系四個發(fā)育期花瓣形態(tài)igure 1.1 Two safflower line (ZHH0119 and XHH007) and their different floret developmental stage, c: ZHH0119 Yellow line. d, e, f: XHH007 White line. a, d: Inflorescence of safflower. b,ongitudinal section of inflorescence from the two lines of different stages. c, f: Differevelopmental stage of petals from two line corresponding to b and e.（二）標準化 cDNA 文庫構建將不同發(fā)育期高質量的 RNA 等量混勻，使用 CloneMiner cDNA Libraonstruction Kit (Invitrogen)試劑盒，并連接 pDONR 222 質粒構建初級 cDNA 文庫用限制性內切酶 Hind III 和 BamH I 消化提取 DNA，經 DNA 結合柱系統(tǒng)純化初DNA 文庫，即可獲得標準化的 cDNA 文庫，，轉化進 Escherichia coli. 感受態(tài)菌H10B 測序。（三）ORF 序列分析使用軟件 TransDecoder 檢測 ORF，方法如下：在轉錄本中鑒定最長的 ORF 序列

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