【摘要】：中藥重樓具有抗癌、殺菌、解蛇毒、治療心血管疾病等功效,是云南白藥、抗癌止痛丸、宮血寧片、季德勝蛇藥片等多種著名中成藥的主要原料。重樓皂苷是重樓最主要的藥用成分,但其生物合成途徑仍不清楚,重樓皂苷的獲取完全依賴于從藥源植物中提取。然而,作為中藥重樓僅有的兩種正品藥源植物的七葉一枝花和滇重樓的野生資源已嚴(yán)重枯竭,瀕臨滅絕。百合科重樓屬植物有40個種及變種,不同種重樓植物所含的重樓皂苷含量和種類不同,其藥理活性的差別也較大。了解不同重樓之間的代謝差異,不僅有助于改善重樓的農(nóng)藝性狀和提高重樓對環(huán)境條件的適應(yīng)性,還可以幫助我們尋找正品藥源植物的替代物。但是目前關(guān)于重樓屬植物的研究報道,多集中于藥理作用、種子萌發(fā)、以及生理生化指標(biāo)測定等方面,這些信息無法闡明不同物種基因型控制的中藥藥用成分多樣性及其潛在的分子機制。重樓代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)特征方面相關(guān)信息的缺乏,阻礙了對這些植物的深入研究,并限制其應(yīng)用。為闡明不同種重樓間皂苷合成的分子調(diào)節(jié)機制,我們以七葉一枝花(P.polyphylla var.chinensis,PPC)、球藥隔重樓(P.fargesii Franch,PFF)和滇重樓(P.polyphylla var.yunnanensis,PPY)這三個不同種重樓屬植物的根部組織為研究材料,采用基于SWATH-MS(Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra)技術(shù)的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法,和基于LC-MS(Liquid Chromatography-Mass Spectroscopy)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)方法,分別進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)分析以及組學(xué)間的整合分析。七葉一枝花和滇重樓是藥典中的正品藥源植物,而文獻(xiàn)報道,球藥閣重樓與滇重樓具有相似的細(xì)胞毒性,可作為抗腫瘤的潛在藥物,因此選擇這三種重樓作為研究對象。本研究不僅是首次關(guān)于重樓屬植物的蛋白質(zhì)組學(xué)報道,同時也是首次在不同種重樓間,開展蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)綜合分析的研究。主要研究結(jié)果如下:(1)蛋白質(zhì)組分析中,我們共鑒定到419個具有顯著性表達(dá)量差異的蛋白質(zhì)。在PPY與PPC的比對分析中,共篩選出236個差異蛋白質(zhì),其中82個下調(diào),154個上調(diào)。PFF與PPC相比較,共有328個差異蛋白質(zhì),其中128個下調(diào),200個上調(diào)。PPY與PPC、PFF與PPC這兩個比對組中,共同出現(xiàn)的蛋白質(zhì)分別有34個下調(diào)和87個上調(diào)。此外,有34個蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在PPY與PPC比較中,46個蛋白質(zhì)是PFF與PPC比對組所獨有的。(2)蛋白質(zhì)的功能分析表明,419個差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要分布在代謝過程、細(xì)胞過程和單個有機體過程這三類;細(xì)胞組分中分布在細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞器這三類的蛋白質(zhì)占多數(shù);分子功能中差異蛋白質(zhì)主要包含有催化活性、結(jié)合和結(jié)構(gòu)分子活性等類型。COG(Cluster of orthologous group)分析的結(jié)果顯示,共有319個差異表達(dá)蛋白質(zhì)獲得匹配的COG信息,其中包含差異蛋白質(zhì)數(shù)目較多的類型分別是糖轉(zhuǎn)運與代謝(52個),一般功能預(yù)測(49個),翻譯后修飾(38個),能量生成與轉(zhuǎn)化(37個),氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝(35個),翻譯核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(22個),次生代謝產(chǎn)物的生物合成、運輸和分解代謝(14個)。(3)KEGG代謝通路富集分析顯示,碳代謝(48個)、氨基酸合成(32個)、苯丙素生物合成(18個)、蛋白質(zhì)加工(16個)以及丙酮酸代謝(15個)等途徑中富集到的差異蛋白質(zhì)數(shù)目較多。此外,我們在關(guān)注皂苷合成有關(guān)的信號通路中發(fā)現(xiàn),淀粉和糖代謝(31個)、糖酵解(16個)、萜類骨架合成(4個)、甾體合成(2個)以及核苷糖代謝途徑(14個)中均有差異蛋白質(zhì)的富集,提示這些蛋白質(zhì)的差異表達(dá),與不同種重樓的皂苷含量高低密切相關(guān)。(4)代謝組學(xué)分析中,我們共鑒定到80個化合物,包括甾體皂苷類、植物甾醇類、膽甾烷醇類、萜類化合物、黃酮類化合物等化學(xué)成分。通過定性定量及PCA,PLS-DA分析,重樓皂苷H、重樓皂苷VI、番茄苷、薯蕷皂苷元、重樓皂苷B、重樓皂苷A這6個差異代謝物可以作為3種重樓潛在的分類標(biāo)志物。其中,重樓皂苷H,薯蕷皂苷元,番茄苷可作為鑒別PFF與PPC以及PFF與PPY之間的潛在分類標(biāo)志物;重樓皂苷H,薯蕷皂苷元,番茄苷,重樓皂苷VI,重樓皂苷A和重樓皂苷B是PPC和PPY之間的主要顯著差異代謝物。(5)蛋白質(zhì)組學(xué)與代謝組學(xué)整合分析顯示,所篩選的的差異蛋白質(zhì)與差異代謝物之間的相關(guān)性非常顯著,并且共計11個重樓皂苷及皂苷元都表現(xiàn)出與差異蛋白質(zhì)的強相關(guān)性。代謝通路整合分析結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)和代謝物的定量差異結(jié)果提示:PPC組的蔗糖利用效率更高,在糖代謝通路中相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)量也更高;PPC中更高含量的丙酮酸和對乙酰輔酶A的高利用率可能是PPC中重樓總皂苷含量較高的原因之一。(6)組學(xué)結(jié)果驗證分析中,采用PRM技術(shù)和HPLC方法分別對部分相關(guān)蛋白質(zhì)和代謝物結(jié)果進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明,目標(biāo)蛋白質(zhì)的PRM方法的定量結(jié)果與SWATH方法的定量結(jié)果基本一致。HPLC方法的定性檢測結(jié)果和LC-MS的定性結(jié)果基本一致,定量結(jié)果表現(xiàn)出不同,但3種重樓的總皂苷含量與當(dāng)前已有的研究結(jié)果趨于一致。通過對這些差異蛋白質(zhì)和代謝標(biāo)志物的分析,使我們能夠更深層次的明晰不同種重樓調(diào)控有效成分合成和代謝的關(guān)鍵途徑,并為重樓生長培育的人工干預(yù),相關(guān)藥效成分的提高,以及物種的基因改良奠定理論基礎(chǔ);為重樓近緣物種鑒別、真假藥鑒別等提供潛在的標(biāo)志物;為抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、心血管等疾病的藥物研發(fā)提供有價值的線索。
【圖文】：

圖 1.1 LC-MS 的靶向(a)與非靶向(b)代謝組學(xué)流程[54]1.6.3.1. 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析中的化學(xué)計量學(xué)方法對檢測到的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分類并找到相關(guān)代謝標(biāo)記物是代謝組學(xué)研究中數(shù)據(jù)分析的重要內(nèi)容[55]。模式識別技術(shù)被大量應(yīng)用于代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析過程中包括有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法和非監(jiān)督學(xué)習(xí)方法[56]。有監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法主要是基于偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）[57]，人工神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[58]分析等數(shù)據(jù)分析方法。無監(jiān)督的學(xué)習(xí)方法主要包括主成分分析（Principal componentanalysis，PCA）[59]、非線性映射（Nonliner mapping，NLM）[60]、簇類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）等[61]。代謝組學(xué)研究中最常用的模式識別方法是 PCA 和 PLS-DA，分析結(jié)果包括得分圖(scoreplot)和載荷圖(loadingplot)，得分圖表示樣品的分類情況，載荷圖表示化合物對樣本分類的貢獻(xiàn)值情況，從而找到可用于樣本分類的代謝標(biāo)記物。近年來 SVM（支持向量機）方法被應(yīng)用于代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析中[62]，相比 PLS-DA方法，其對樣本的分類及代謝標(biāo)志物的篩選具有更高的精確度[63]。

測定試劑盒。分光光度計下進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，保證每個樣品的濃度達(dá)到1mg/mL，測定結(jié)果見表2.3。濃度測定中標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99以上（圖2.1）。從表2.3和圖2.1可知，蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果可靠，并且所提取的各蛋白濃度均能達(dá)到實驗需要。進(jìn) 步對所提取蛋白進(jìn)行質(zhì)量評價。利用SDS凝膠電泳分析蛋白樣品的完整性，電泳圖譜見圖2.1。由電泳結(jié)果可知，，所提取的總蛋白的質(zhì)量和完整性較好，能夠滿足試驗的需要。圖 2.1 三組重樓全蛋白提取液的 SDS-PAGE 電泳圖
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S567.239

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2662165