【摘要】：芥菜型油菜中存在自發(fā)突變的多室角果,多室角果具有3~5個心室,能夠增加每角果粒數(shù)而達到增產(chǎn)目的。青海芥菜型多室油菜的多室性狀受兩對獨立遺傳的隱性核基因(Bjln1和Bjln2)控制。為揭示多室性狀的形成機理,本研究通過圖位克隆的方法分離了青海芥菜型多室油菜的多室基因Bjln1,同時結(jié)合細胞學及分子生物學方法,初步闡述了Bjln1基因在青海芥菜型多室油菜中的功能。主要研究結(jié)果如下:1.將BjLn1精細定位至85 Kb的區(qū)間內(nèi):利用青海芥菜型多室油菜和二室親本“塔油2號”構(gòu)建的BC_3群體,通過圖位克隆的方法將多室基因Bjln1定位至白菜A07染色體上約85 Kb的區(qū)間內(nèi)。結(jié)合比較基因組學分析,預測擬南芥CLV1同源基因為BjLn1的候選基因,將該候選基因命名為BjuA07.CLV1。2.BjuA07.CLV1具有恢復二室性狀的能力:以純合二室親本DNA為模板,設計全長擴增引物,獲得5365 bp BjuA07.CLV1 gDNA全長序列,將該序列引入pCAMBIA2300表達載體,轉(zhuǎn)入青海芥菜型多室油菜,轉(zhuǎn)基因T_0代共獲得58株陽性苗,25株表現(xiàn)不同程度的二室角果恢復,6株中80%的多室角果恢復為二室,恢復較高的T_0代植株T26套袋自交,T_1代單株共包含42株,其中二室單株與多室單株分離比接近3:1,說明T26中僅在一個拷貝上有目標片段的插入,特異性引物檢測42個單株中外源片段BjuA07.CLV1的插入,與表型一一對應。緊密連鎖的分子標記檢測42個T_1植株基因型與表型完全共分離。說明BjuA07.CLV1成功整合至青海芥菜型多室油菜中,并將多室角果恢復為二室。因此,BjuA07.CLV1即是BjLn1基因,等位基因Bjln1被命名為BjuA07.clv1。3.BjuA07.CLV1中第28和63位氨基酸變化影響角果心室數(shù)目:通過BjuA07.CLV1與BjuA07.clv1 cDNA、gDNA序列的比對分析,BjuA07.CLV1編碼區(qū)由兩個外顯子和一個內(nèi)含子組成,CDS序列為2964 bp,共編碼987個氨基酸。BjuA07.CLV1與BjuA07.clv1 CDS序列中存在59個SNPs的差異,其中第83位,119位,151位,187位和1014位的5個SNPs引起第28位,40位,51位,63位和338位的5個氨基酸變異。為檢測這5個非同義SNPs引起的氨基酸變化是否影響B(tài)juA07.CLV1功能,分別構(gòu)建載體pBjuA07.CLV1::BjuA07.CLV1(載體1)和pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(載體2),轉(zhuǎn)化擬南芥CS45突變體,結(jié)果顯示,載體2轉(zhuǎn)入后擬南芥二室角果的恢復率顯著低于載體1,暗示了BjuA07.clv1 CDS中的5個非同義SNP突變影響角果的心室數(shù)目。為確定與心室數(shù)目變化相關的具體SNP,分別構(gòu)建5個SNP突變檢測載體,pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(83 T→C)(載體3)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(119 A→C)(載體4)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(151 C→A)(載體5)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(187 T→G)(載體6)、pBjuA07.CLV1::BjuA07.clv1(1014 G→C)(載體7),分別轉(zhuǎn)入擬南芥CS45突變體,T_1代植株均表現(xiàn)二室角果的部分恢復,載體4、5和7轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率與載體2轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率均無顯著差異,而載體3和載體6轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率均顯著高于載體2。此外,載體3和載體6轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率與載體1轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率無顯著差異,說明擬南芥CS45突變體中多室角果恢復為二室,主要與載體3和載體6的轉(zhuǎn)入緊密相關。最終證實BjuA07.clv1 CDS中第83位和187位的2個SNPs導致對應第28位和63位氨基酸發(fā)生變異,影響了BjuA07.clv1基因功能而引起角果心室數(shù)目的增多。4.BjuA07.clv1啟動子區(qū)702 bp堿基缺失影響心室數(shù)目:與二室基因BjuA07.CLV1相比,多室基因BjuA07.clv1在起始密碼子上游1015 bp位置處發(fā)生702 bp的堿基缺失。為檢測702 bp的堿基缺失是否影響啟動子功能,選擇植物雙元表達載體pCAMBIA2300,構(gòu)建載體pBjuA07.clv1(702 bp deletion at position-1015)::BjuA07.CLV1(載體8),轉(zhuǎn)入擬南芥CS45突變體。T_1代共獲得11株陽性苗,11株中部分多室角果恢復為二室角果,pBjuA07.clv1(702 bp deletion at position-1015)::BjuA07.CLV1(載體8)轉(zhuǎn)基因植株二室角果恢復率顯著低于pBjuA07.CLV1::BjuA07.CLV1(載體1),暗示了BjuA07.clv1啟動子區(qū)702 bp堿基缺失影響啟動子功能而導致心室數(shù)目增多。5.多室與二室油菜表型觀察比較:為了揭示多室性狀的形成過程,以雙親、BC_3F_5群體中純合的二室和多室單株為材料,通過石蠟切片結(jié)合掃描電鏡觀察二者的花芽分化過程,比較二室與多室差異,結(jié)果表明,青海芥菜型多室油菜自出苗開始,約22 d左右,平均葉片數(shù)為5時,開始花芽分化且經(jīng)歷5個時期;二室與多室在SAM、FM、心室、柱頭和籽粒排列數(shù)中存在差異。6.BjuA07.CLV1影響SAM、FM的直徑大小:在花芽分化中后期,多室油菜SAM直徑顯著大于二室,認為二室油菜和多室油菜出現(xiàn)分化差異的最早組織是SAM,該差異一直維持到花芽原基的出現(xiàn);利用顯微鏡測微尺測量比較花芽原基縱切面,發(fā)現(xiàn)多室FM直徑顯著大于二室FM。該結(jié)果表明,BjuA07.CLV1主要影響莖頂端分生組織(SAM)和花頂端分生組織(FM)的直徑大小。7.BjuA07.CLV1影響角果內(nèi)心室數(shù)及籽粒列數(shù):心皮分化時期,花芽頂端分生組織發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化。二室花芽頂端向內(nèi)凹陷成“I”狀裂口,形成2塊心皮,將花芽中心生長錐分隔成2個大小基本相等的腔室,中間是一列假隔膜,兩側(cè)各著生一列籽粒,最終形成含兩個心皮和兩列籽粒的二室角果,多室花芽頂端向內(nèi)凹陷成“X”狀裂口,形成4個心皮,將花芽中心生長錐分隔為4個區(qū)域,隨之形成相對應的4個子房腔,伴有2個平行式的假隔膜,并著生四列種子,最終形成含有四個心皮和四列籽粒的四室角果。多室油菜每角粒數(shù)的增加主要來自于種子列數(shù)的增加。8.BjuA07.CLV1和BjuA07.clv1在轉(zhuǎn)錄水平上存在顯著差異:為了解BjuA07.CLV1與BjuA07.clv1基因的表達模式,通過qRT-PCR結(jié)合GUS染色實驗,研究二者在葉片、根、莖稈、莖生葉、SAM、花蕾、花、雌蕊和角果組織中的表達量。qRT-PCR結(jié)果顯示,BjuA07.CLV1在根、葉片、莖生葉、莖桿、SAM、蕾、花和角果中都有表達。Pro _(BjuA07.CLV1)-GUS載體轉(zhuǎn)入擬南芥Columbia后,T_1代植株的不同組織中均檢測到GUS染色,表達模式與qRT-PCR結(jié)果基本一致。相較于BjuA07.CLV1,BjuA07.clv1在莖桿、SAM和花蕾中的表達量顯著降低。暗示了BjuA07.clv1啟動子區(qū)702 bp的堿基缺失影響該基因的表達。9.BjuA07.CLV1編碼定位于細胞質(zhì)膜的受體激酶:將BjuA07.CLV1氨基酸序列提交到NCBI進行Blast P分析,共檢索到14條同源性較高的蛋白序列,用MEGA4.0軟件對BjuA07.CLV1蛋白序列及其14個同源序列做進化樹分析,結(jié)果顯示,BjuA07.CLV1蛋白序列與甘藍型油菜BnCLV1和白菜型油菜BrCLV1的序列相似度皆超過90%,在進化過程中,BjuA07.CLV1與BrCLV1相當接近。BjuA07.CLV1與擬南芥AtCLV1具有較高的同源性,序列相似度達到88%。在ExPASy網(wǎng)站預測BjuA07.CLV1蛋白結(jié)構(gòu),由一個胞外富含亮氨酸重復序列(LRRs),一個跨膜結(jié)構(gòu)域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點組成,與AtCLV1蛋白結(jié)構(gòu)相似。為了進一步驗證BjuA07.CLV1與擬南芥中AtCLV1具有相似的蛋白功能,構(gòu)建BjuA07.CLV1與GFP融合表達載體,轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體,發(fā)現(xiàn)BjuA07.CLV1-GFP綠色熒光定位到細胞質(zhì)膜上,認為BjuA07.CLV1與AtCLV1具有相似的蛋白功能,編碼定位于細胞質(zhì)膜上的受體激酶,在細胞信號轉(zhuǎn)導過程發(fā)揮作用。10.BjuA07.clv1干擾CLV/WUS調(diào)控通路:以BC_3F_5群體中多室植株和純合二室植株的SAM組織為材料,通過qRT-PCR分析BjuA07.CLV1和CLV/WUS信號調(diào)控途徑中其他8個相關基因在多室和二室SAM中的動態(tài)表達差異。結(jié)果顯示,WUS、CLV3、RPK2和POL在多室SAM中的表達高于二室,而CLV2和BjuA07.CLV1(CLV1)在多室SAM中的表達量顯著低于二室。認為POL基因在多室SAM中表達水平的提高,減弱了CLV3的信號傳遞,解除了WUS的表達限制,產(chǎn)生更多干細胞,使SAM膨大。因此,BjuA07.clv1在多室SAM中的變異擾亂了CLV/WUS信號傳導途徑,導致SAM增大,形成多室角果。
【圖文】：

當?shù)谒�、第�?FM出現(xiàn)時，早期的 FM 已經(jīng)啟動 萼片的分 化 （ 圖1.7.1-a 所示）[51,52]。圖 1.7.1-a 擬南芥 SAM 和 FM 組織結(jié)構(gòu)特征（Meyerowitz 1997）Fig 1.7.1-a Structural characteristic of SAM and FM in A. thaliana (Meyerowitz 1997)

圖 1.7.2-a 擬南芥 SAM 關鍵調(diào)控基因的表達模式（Nakajima 和 Benfey 2002）ig. 1.7.2-a Expression patterns of key SAM regulatory genes in A. thaliana (Nakajima aBenfey 2002)： a：wus突變體 SAM 結(jié)構(gòu)（左）與野生型 WUS 基因表達模式（右）；b：stm突變M 結(jié)構(gòu)（左）和野生型 STM 基因表達模式；c：由 clv1、clv2 或 clv3 功能缺失突變引的 SAM 結(jié)構(gòu)（左）與野生型 CLV1和 CLV3的基因表達模式（右）。Note: a: SAM structure of loss-of-function wus mutants (left) and wild-type WUS genexpression (right); b: SAM structure of strong loss-of-function stm mutants (left) and wild-tyTM gene expression (right); c: SAM structure caused by a loss-of-function mutation in clv1clv2, or clv3 (left) and gene expression patterns of CLV1 and CLV3 (right).WUS（WUSCHEL）調(diào)控基因編碼 1 個同源異型結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子，在擬 SAM 的 L3 層及更底層的 10 個細胞中表達，為組織中心[61]。WUS 突變可M 中干細胞分化加速，使細胞數(shù)目減少，從而 SAM 變小，并提前終止 F分化，影響花器官形成，改變心皮及雄蕊的數(shù)目。WUS 超量表達時，促進胞的產(chǎn)生，使 SAM 和 FM 變大，促進花器官的形成[57,67,68]。因此，，WUS
【學位授予單位】：青海大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S565.4

【參考文獻】

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本文編號：2644335