【摘要】：TCP(TEOSINTE-BRANCHED1/CYCLOIDEA/PCF)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族,含有保守的TCP結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域是由60個氨基酸組成的bHLH結(jié)構(gòu),是DNA結(jié)合與蛋白間互作所必需的。TCP轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程,如調(diào)控?cái)M南芥葉片、花發(fā)育、種子萌發(fā)等過程,同時也能夠調(diào)控棉花纖維伸長。棉花(Gossypium)是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,其產(chǎn)生的棉纖維是紡織行業(yè)中使用最多的天然纖維,在國民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。二倍體棉種雷蒙德氏棉、亞洲棉以及異源四倍體棉種陸地棉、海島棉基因組測序的完成,為全面鑒定棉花TCP基因家族成員提供了良好的機(jī)會。目前TCP轉(zhuǎn)錄因子家族在棉花中研究報(bào)道還比較少,因此全面鑒定棉花中TCP基因家族成員以及對其進(jìn)行相應(yīng)的功能研究具有重要意義。本研究對異源四倍體棉種陸地棉和海島棉中各自的TCP基因家族成員進(jìn)行全面鑒定,并在此基礎(chǔ)上,對陸地棉、海島棉TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員分類、染色體上的分布特征、不同組織表達(dá)水平等方面進(jìn)行了分析;利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(VIGS),沉默陸地棉多數(shù)組織中優(yōu)勢表達(dá)的基因GhTCP2A/2D、GhTCP24A/24D和GhTCP3A/3D的表達(dá),研究其功能及作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:1陸地棉和海島棉TCP蛋白家族成員的鑒定和進(jìn)化分析以雷蒙德氏棉和亞洲棉的TCP蛋白序列為參考,在陸地棉和海島棉蛋白數(shù)據(jù)庫中對兩者的TCP蛋白家族成員進(jìn)行鑒定,最終在陸地棉和海島棉基因組中,分別鑒定得到73和69個編碼TCP轉(zhuǎn)錄因子的基因。在這四個棉種中,亞家族Ⅰ類成員數(shù)目最多,占到60%以上;亞家族Ⅱ類中,CYC/TB1簇成員數(shù)目最少,且CIN簇成員數(shù)目是CYC/TB1簇成員數(shù)目的2倍。對雷蒙德氏棉、亞洲棉、陸地棉和海島棉TCP蛋白家族成員對比分析,最終得到40個棉花TCP參考蛋白,應(yīng)用MEGA 6.0軟件對棉花TCP轉(zhuǎn)錄因子家族成員進(jìn)化分析。結(jié)果顯示,棉花TCP轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為A-G共7簇。2 TCP家族基因在棉花基因組中的分布以雷蒙德氏棉TCP基因在染色體上的分布情況為參照,應(yīng)用MapInspect軟件對陸地棉和海島棉TCP基因在染色體上的分布情況進(jìn)行分析,陸地棉和海島棉TCP基因在染色體上的分布情況大致相同。TCP基因除了在四倍體棉花的6號染色體上沒有分布外,其余染色體上均有TCP基因的分布,12號染色體上TCP基因分布最多。3 TCP基因在棉花中的表達(dá)模式檢測對陸地棉和海島棉不同葉齡期CIN類TCP基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)CIN類TCP基因在這兩大四倍體棉種中的表達(dá)水平無明顯變化。同時本論文關(guān)注的基因TCP2A/2D、TCP24A/24D伴隨著葉片發(fā)育兩者表達(dá)水平變化趨勢相反,而TCP3A/3D表達(dá)水平基本無變化。對陸地棉CIN類TCP基因家族所有成員在各組織中的表達(dá)模式進(jìn)行Heatmap分析,結(jié)果顯示,與CIN類其它基因的表達(dá)水平相比,GhTCP2A/2D、GhTCP24A/24D和GhTCP3A/3D的表達(dá)在陸地棉多數(shù)組織中優(yōu)勢表達(dá)。同時,選取陸地棉5個組織(根、莖、葉、花瓣以及開花后5天纖維),對CIN類TCP基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)葉片和花瓣中的表達(dá)水平均高于其它組織。4基因沉默植株葉片腺體數(shù)量增多在棉花植株中利用VIGS技術(shù)沉默GhTCP2A/2D、GhTCP24A/24D和GhTCP3A/3D的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)GhTCP2A/2D、GhTCP24A/24D表達(dá)水平降低后,棉花成熟葉片腺體數(shù)量明顯增多;當(dāng)GhTCP3A/3D表達(dá)水平降低后,棉花葉片卷曲,但葉片腺體數(shù)量無明顯變化。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明,GhTCP2A能夠與棉花腺體形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子GoPGF發(fā)生相互作用。5 TRV:GhTCP2A棉花植株葉片轉(zhuǎn)錄組分析對基因GhTCP2A/2D表達(dá)水平降低的植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平明顯變化的下游基因包括激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),茉莉酸JA合成酶基因表達(dá)明顯上調(diào),幼嫩葉片茉莉酸含量升高,這可能是棉花葉片腺體數(shù)量增加的原因。基于以上研究結(jié)果,本試驗(yàn)一共得到40個棉屬TCP參考基因;同時發(fā)現(xiàn)GhTCP24A/24D是棉花葉片腺體分化的負(fù)調(diào)控因子。
【圖文】：

圖 1.1.1 擬南芥 TCP 轉(zhuǎn)錄因子家族 TCP 結(jié)構(gòu)域比對分析 (Martin-Trillo and Cubas, 2010)Figure 1.1.1 Alignment of TCP sequences of Arabidopsis TCP family (Martin-Trillo and Cubas,2010)1.1.3 TCP 基因家族的生化功能Kosugi等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)破壞TCP結(jié)構(gòu)域后，TCP轉(zhuǎn)錄因子就無法結(jié)合下游基因。因此，TCP結(jié)構(gòu)域是TCP蛋白調(diào)控下游基因保守且必須的(Kosugi and Ohashi, 1997)。兩大亞家族成員結(jié)合DNA位點(diǎn)序列不同但有部分重疊，其中I類蛋白結(jié)合位點(diǎn)序列：GGNCCCAC(Kosugi and Ohashi, 2002) ， II 類 蛋 白 結(jié) 合 位 點(diǎn) 序 列 ：GTGGNCCC(Masuda et al., 2008)。當(dāng)然也有例外，I類TCP蛋白成員AtTCP15會間接調(diào)控由CIN家族成員調(diào)控的基因的表達(dá)(Koyama et al., 2010)；茉莉酸JA合成酶基因LIPOXYGENASE2(LOX2)，存在AtTCP20 (I類)和AtTCP4 (II類)共同的靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)(Schommer et al., 2008; Danisman et al., 2012)。因此兩類TCP轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合序列并不是絕對的，，兩者的結(jié)合可能存在競爭關(guān)系。研究顯示，TCP 蛋白對下游基因兼具轉(zhuǎn)錄激活作用和轉(zhuǎn)錄抑制作用。兩大亞家族都包含轉(zhuǎn)錄激活因子，如I類AtTCP20對基因CYCB1有轉(zhuǎn)錄激活作用(Li et al.,

家族調(diào)控植物發(fā)育因在葉片發(fā)育中的功能芥 24 個 TCP 家族成員被鑒定出來以后，TCP 基因家族能作用越來越多地被揭示，它們廣泛參與調(diào)控葉片花育，花色素合成以及植物體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等（圖 1.1 類和 II 類 TCP 基因家族成員在調(diào)控植物生長發(fā)育方面家族成員會競爭性結(jié)合序列相似的順勢作用元件(Li, 族中 CIN 類型的 TCP 基因在葉片發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中有重現(xiàn) CIN 基因時，發(fā)現(xiàn)將其突變，會出現(xiàn)葉片邊緣細(xì)胞生褶皺表型(Nath et al., 2003)。擬南芥 CIN 類基因家族2、3、4、5、10、13、17 和 24。擬南芥 jaw-D 突變體中基因 AtTCP2、3、4、10 和 24 可被其識別并降解，降），導(dǎo)致該突變體呈現(xiàn)出葉片變大、褶皺、邊緣鋸齒狀
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S562

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2644376