【摘要】：甘草作為我國最常用的大宗藥材之一,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,在中國有著兩千多年的藥用歷史,具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等作用。2015版《中華人民共和國藥典》明確規(guī)定按干燥品計(jì)算,甘草樣品中甘草苷(C21H22O9)的含量不得低于0.50%。本課題組前期調(diào)查研究發(fā)現(xiàn):大量栽培甘草中甘草苷的含量難以達(dá)到藥典規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)重影響栽培甘草的質(zhì)量。因此,本課題首先采用X射線輻照處理甘草種子,以期通過基因突變快速獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的甘草栽培品。為進(jìn)一步闡釋烏拉爾甘草黃酮代謝途徑的分子機(jī)制:一方面從甘草苷生物合成關(guān)鍵功能基因CHS和CHI的基因多態(tài)性進(jìn)行分析;另一方面挖掘其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),解析影響甘草黃酮類化合物生物合成途徑的主要差異表達(dá)基因。本論文采用6個(gè)梯度X射線輻照處理烏拉爾甘草種子,栽培一年后,利用HPLC法對獲得的188株甘草樣品中4種主要黃酮類化合物(甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素)進(jìn)行含量分析,篩選出5株黃酮含量及產(chǎn)量較高的輻照甘草樣品以及5株黃酮含量及產(chǎn)量較低的空白樣品作為功能基因分析的實(shí)驗(yàn)材料。采用RT-PCR法對10株烏拉爾甘草樣品進(jìn)行CHS和CHI的基因多態(tài)性分析,篩選出黃酮高/低含量組樣品的CHS和CHI主流單倍型;利用生物信息學(xué)軟件對主流CHS和CHI基因單倍型進(jìn)行分析,以解析功能基因多態(tài)性對黃酮類化合物生物合成的影響。進(jìn)一步篩選出2個(gè)黃酮類含量及產(chǎn)量較高的輻照甘草樣品和1個(gè)黃酮類含量及產(chǎn)量較低的空白甘草樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,獲得影響甘草黃酮類化合物生物合成的5條代謝途徑,并對其差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR基因相對表達(dá)量分析。本論文取得的研究結(jié)果如下:(1)X射線輻照處理對烏拉爾甘草黃酮類化合物積累水平的影響研究運(yùn)用HPLC法對188株甘草樣品中的甘草苷、異甘草苷、甘草素和異甘草素進(jìn)行含量測定,并計(jì)算其產(chǎn)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn):大部分輻照甘草樣品中甘草苷、異甘草苷的含量和產(chǎn)量均顯著高于空白對照,且隨著輻照劑量的提高,其含量和產(chǎn)量總體呈現(xiàn)先上升再下降再上升的趨勢。綜合比較,50Gy輻照劑量組的黃酮類成分產(chǎn)量最優(yōu)。以黃酮類化合物高含量和高產(chǎn)量為指標(biāo),篩選出5個(gè)X射線輻照處理甘草樣品:A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4;以黃酮類化合物低含量、低產(chǎn)量為指標(biāo),在空白對照中挑選出5個(gè)樣品:AO-2、BO-1、B0-3、C0-2、C0-3,進(jìn)行進(jìn)一步的功能基因多態(tài)性分析。(2)X射線輻照處理對甘草查爾酮合酶基因多態(tài)性的影響研究采用RT-PCR法,以烏拉爾甘草輻照樣品B6-2、B6-4、C1-1和烏拉爾甘草空白樣品BO-1、B0-3、C0-2為實(shí)驗(yàn)材料,共克隆得到115條CHS基因cDNA序列,全長均為1175bp,包含1個(gè)完整的開放閱讀框,編碼389個(gè)氨基酸殘基。確定了91種CHS單倍型,65種CHS氨基酸序列類型�？瞻讓φ战M中存在54種單倍型,其中單倍型24為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-13。輻照處理組中存在37種單倍型,其中單倍型61為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-47;單倍型54出現(xiàn)頻次也較高,其編碼氨基酸序列類型AA-48。氨基酸變異位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn):193位點(diǎn)的V/I變異,229位點(diǎn)的I/V變異,383位點(diǎn)的I/V變異可能影響黃酮的積累水平。(3)X射線輻照處理對甘草查爾酮異構(gòu)酶基因多態(tài)性的影響研究采用RT-PCR法,以烏拉爾甘草輻照樣品A6-1、B6-2、B6-4、C1-1、C3-4和烏拉爾甘草空白樣品A0-2、B0-1、B0-3、C0-3為實(shí)驗(yàn)材料,共克隆得到173條CHI基因cDNA序列,全長均為690bp,包含1個(gè)完整的開放閱讀框,編碼229個(gè)氨基酸殘基。共確定了111種CHI單倍型,89種CHI氨基酸序列類型。空白對照組中存在47種單倍型,其中單倍型68為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-57。輻照處理組中存在67種單倍型,其中單倍型3為主流單倍型,編碼氨基酸序列類型AA-3。CHI氨基酸序列的82位點(diǎn)D/E突變可能與黃酮含量積累水平有關(guān)。(4)甘草黃酮高/低含量組特異CHS氨基酸序列生物信息學(xué)分析對空白甘草樣品CHS主流氨基酸序列類型AA-13以及輻照處理甘草樣品CHS主流氨基酸序列類型AA-47及AA-48進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其物理化學(xué)性質(zhì)相近。AA-13與AA-47的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)較為接近,均與AA-48存在差異。三者均不含信號(hào)肽,位于膜外,無跨膜結(jié)構(gòu)域,推測CHS不是分泌型蛋白而是留在細(xì)胞質(zhì)中催化合成類黃酮等物質(zhì)。此外,不同物種間CHS序列區(qū)分度良好。根據(jù)模建蛋白的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測,甘草黃酮高含量組主流氨基酸序列類型AA-47的383位纈氨酸是蛋白結(jié)合位點(diǎn),能夠與香豆酰輔酶A結(jié)合。甘草黃酮高含量組的主流氨基酸序列類型AA-48的229位纈氨酸是蛋白結(jié)合位點(diǎn),能夠與丙二酰輔酶A結(jié)合。而甘草黃酮低含量組主流氨基酸序列類型AA-13的229位和383位的異亮氨酸均不是蛋白結(jié)合位點(diǎn)。(5)甘草黃酮高/低含量組特異CHI氨基酸序列生物信息學(xué)分析對空白甘草樣品CHI主流氨基酸序列類型AA-57以及輻照處理甘草樣品CHI主流氨基酸序列類型AA-3進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)兩者物理化學(xué)性質(zhì)相近,二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)均相似。兩者均不含信號(hào)肽,位于膜外且無跨膜區(qū),推測CHI不是分泌型蛋白而是留在細(xì)胞質(zhì)中催化合成類黃酮等物質(zhì)。此外,不同物種間CHI序列區(qū)分度良好。AA-3在82位點(diǎn)為天冬氨酸(D),AA-57在82位點(diǎn)為谷氨酸(E)。82位點(diǎn)D/E變異僅出現(xiàn)在空白對照組氨基酸序列中。但通過模建蛋白結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測,發(fā)現(xiàn)AA-3與AA-57的82位點(diǎn)氨基酸殘基均不是底物結(jié)合位點(diǎn)。(6)黃酮類化合物差異積累的烏拉爾甘草樣品轉(zhuǎn)錄組分析高含量高產(chǎn)量輻照組烏拉爾甘草樣品C3-4、B6-4和低含量低產(chǎn)量空白組烏拉爾甘草樣品B0-1分別重新命名為H1、H2和L1。獲得這3個(gè)烏拉爾甘草樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),其正確率高,基因組覆蓋率良好。獲得了3795個(gè)以上新轉(zhuǎn)錄本,豐富了甘草的基因庫。基因表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn):3個(gè)樣本間的差異較大,H1與L1、H2與L1兩兩比較,分別獲得了4527和4230個(gè)差異基因,2個(gè)比較組共有1875個(gè)核心差異基因。H1和H2樣品的核心差異基因表達(dá)模式基本一致,而L1樣品表達(dá)上調(diào)的基因多于H1和H2。因此推測輻照處理可能影響甘草基因表達(dá)水平,從而影響甘草黃酮類化合物的積累。共確定5條代謝途徑上的核心差異基因與黃酮類化合物生物合成密切相關(guān),包括:黃酮類化合物代謝途徑、萜類代謝途徑、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、植物晝夜節(jié)律調(diào)控通路、淀粉和蔗糖代謝途徑。5條代謝途徑上的核心差異基因如下:在甘草黃酮類代謝途徑上,共獲得23個(gè)核心差異基因。其中H1和H2共同下調(diào)基因10個(gè),包括:1個(gè)苯丙氨酸解氨酶基因,1個(gè)β-葡萄糖苷酶基因,1個(gè)咖啡酸3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶基因,2個(gè)松柏醛脫氫酶基因和5個(gè)過氧化物酶基因。苯丙氨酸解氨酶是苯丙素生物合成途徑的關(guān)鍵酶,輻照樣品H1和H2中編碼該酶的基因表達(dá)量下調(diào)則表明輻照處理可能抑制了該酶的表達(dá),從而影響黃酮類化合物的積累。此外,相對于L1而言,H1中的2個(gè)查爾酮合酶基因表達(dá)顯著上調(diào),該基因?yàn)楦什蔹S酮合成途徑上的關(guān)鍵酶基因,極大影響黃酮類化合物的生物合成。下游旁路途徑的β-葡萄糖苷酶、松柏醛脫氫酶和過氧化物酶的基因表達(dá)均下調(diào),表明苯丙素類代謝途徑上的反應(yīng)底物大多流向黃酮合成途徑,從而導(dǎo)致輻照樣品中黃酮類化合物大量積累。在萜類代謝途徑上,共獲得9個(gè)核心差異基因。其中H1和H2共同上調(diào)基因有5個(gè),分別為1個(gè)9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因,該基因編碼脫落酸,與黃酮類化合物積累相關(guān);1個(gè)赤霉素2-氧化酶基因和2個(gè)赤霉素3-β-雙加氧酶基因具有調(diào)節(jié)植物光合作用,影響植物初生代謝功能,從而為黃酮等次生代謝產(chǎn)物積累提供底物;1個(gè)1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因上調(diào),促進(jìn)單萜、二萜和類胡蘿卜素生物合成。H1和H2共同下調(diào)基因僅1個(gè),即辣椒紅素合成酶基因,該基因下調(diào)有利于脫落酸的合成,促進(jìn)黃酮類化合物的積累。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上,共獲得18個(gè)核心差異基因。其中H1和H2共同上調(diào)基因有3個(gè),分別為蛋白運(yùn)輸抑制基因、赤霉素受體GID1基因和茉莉酸甲酯-結(jié)構(gòu)域蛋白5基因。前二者基因表達(dá)上調(diào),促進(jìn)蛋白泛素化和二萜生物合成。茉莉酸甲酯-結(jié)構(gòu)域蛋白5基因則誘導(dǎo)植物莖成熟和抗脅迫作用,表明輻照處理可能加快了植物成熟并促進(jìn)植物抗逆能力。其中H1和H2共同下調(diào)基因有10個(gè),分別為4個(gè)SAUR生長素超家族反應(yīng)蛋白基因,1個(gè)生長素反應(yīng)性GH3家族蛋白基因,3個(gè)吲哚乙酸誘導(dǎo)蛋白10基因,1個(gè)含有組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移因子5基因和1個(gè)響應(yīng)調(diào)節(jié)器4基因。前三者下調(diào),表明生長素合成代謝下調(diào)。后兩者下調(diào),表明細(xì)胞分裂素合成代謝下調(diào)。生長素、細(xì)胞分裂素合成代謝下調(diào),則植物生長緩慢,可能反映了輻照植物早熟狀態(tài)。此外,基于生長-分化平衡假說、最佳防御假說和資源獲得假說,生長緩慢則初級(jí)代謝下調(diào)而次級(jí)代謝上調(diào),從而促進(jìn)黃酮類化合物的生物合成。在植物晝夜節(jié)律途徑上,共獲得7個(gè)核心差異基因,在輻照樣品H1和H2中表達(dá)均上調(diào),分別為1個(gè)查爾酮合酶基因,3個(gè)偽響應(yīng)調(diào)節(jié)器5基因,2個(gè)開花蛋白FT基因和1個(gè)生物鐘基因。前兩者分別與甘草抗X射線輻照作用和反饋調(diào)節(jié)作用相關(guān)。后兩者與植物花期調(diào)控相關(guān),進(jìn)一步反映了輻照處理可能使花期提前,而花期中花色素等黃酮下游產(chǎn)物會(huì)影響黃酮類化合物生物合成。在淀粉蔗糖代謝途徑上,共獲得4個(gè)核心差異基因。在H1和H2中共同上調(diào)的基因有2個(gè),分別是1,4-α-葡聚糖分支酶基因和β-淀粉酶基因,促進(jìn)糊精、麥芽糖生成。在H1和H2中共同下調(diào)的基因有2個(gè),分別是α-淀粉酶基因和蔗糖合酶基因。前者下調(diào),則有利于淀粉向糊精、麥芽糖轉(zhuǎn)化,后者下調(diào),則蔗糖合成下調(diào)。綜上,輻照甘草中多糖向單糖轉(zhuǎn)化上調(diào),為次生代謝產(chǎn)物形成糖苷提供基礎(chǔ)。(7)烏拉爾甘草轉(zhuǎn)錄組核心差異基因相對表達(dá)量分析利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對12個(gè)核心差異基因的表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證。苯丙氨酸解氨酶基因PAL(Glyur000106s00011717)、查爾酮合酶基因 CHS1(Glyur000424s00026890)、CHS2(Glyur006062s00044203)、9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶基因NCED(Glyur000278s00017280)、赤霉素2-氧化酶基因GA20x(Glyur000261s00014360)、赤霉素受體基因GID1(Glyur000158s00011331)、生長素超家族反應(yīng)蛋白基因SAUR(Glyur000017s00002448)、β-淀粉酶基因AMYB(Glyur000047s00004005)、咖啡酸3-0-甲基轉(zhuǎn)移酶基因COMT(Glyur000116s00009246)、茉莉酸甲酯-結(jié)構(gòu)域蛋白5基因JAZ(Glyur002299s00036262)、1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因DXS(Glyur000231s00022061)和生物鐘基因LHY(Glyur000116s00009244)。除DXS和COMT基因外,其他基因表達(dá)量的驗(yàn)證結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量分析結(jié)果一致。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S567.71
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本文編號(hào)：2628623