【摘要】：金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl.)為蘭科(Orchidaceae Juss.)石斛屬(Dendrobium Sw.)附生草本多年生植物,是中國藥典歷版收載的中藥材石斛的基源植物之一,具有益胃生津、滋陰清熱之功效,是一種藥用范圍很廣的名貴傳統(tǒng)中藥�，F(xiàn)代的藥理學研究表明了金釵石斛的生物堿對心血管、白內(nèi)障、胃腸道和呼吸系統(tǒng)等疾病具有較好的療效。赤水金釵石斛產(chǎn)量占全國70%,而生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)不同生態(tài)環(huán)境、不同長勢、不同生長年限、不同采收期金釵石斛商品中石斛堿含量差異大,研究還發(fā)現(xiàn)不同生育階段金釵石斛莖中石斛堿含量差異顯著,為保證赤水金釵石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,金釵石斛堿含量的穩(wěn)定可控,了解石斛堿在植株體內(nèi)如何產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運、積累,如何調(diào)控栽培措施,都需要了解金釵石斛堿的代謝機制。而石斛堿在植株體內(nèi)的分布與積累特性不清晰,代謝途徑不清楚,導致石斛堿代謝調(diào)控研究甚少。本試驗以各生育期金釵石斛為試驗材料,研究金釵石斛干物質(zhì)積累與分配規(guī)律、石斛堿積累與分配特性,發(fā)現(xiàn)石斛堿含量與金釵石斛的不同發(fā)育階段有關,為此,以石斛堿含量存在顯著差異的4個時期金釵石斛莖為樣本,進行數(shù)字基因表達譜(Digital Gene Expression Profiling,DGE)的測序,同時構(gòu)建金釵石斛轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)文庫,對4個時期金釵石斛莖差異表達基因(Differenti al Expression genes,DEGs)進行分析,比較差異表達基因的數(shù)量、功能和表達模式,系統(tǒng)篩選參與石斛堿代謝相關基因,并通過實時熒光定量PCR技術進行驗證,初步提出了石斛堿代謝是萜類合成途徑的推論。研究結(jié)果如下:(1)石斛堿含量與金釵石斛的不同發(fā)育階段有關。一年生金釵石斛莖和葉中石斛堿含量出現(xiàn)2次升高的過程,分別是3-6月份、10-12月份和3-6月份、9-12月份;二年生金釵石斛莖和葉中石斛堿含量的2次升高的過程,分別是4-6月份、10-12月份和2-6月份、9-12月份;金釵石斛新芽萌發(fā)生長分別是2-6月份和9-12月份,石斛堿含量的2次升高與金釵石斛的2次新芽萌發(fā)生長在時間上吻合,表明石斛堿含量與金釵石斛幼芽萌發(fā)生長階段有關。(2)石斛堿在金釵石斛幼嫩組織中含量高。一年生金釵石斛莖中石斛堿含量在3-6月份增長的較快,從3月份含量0.22%增長到6月份含量達0.97%,單位干物質(zhì)石斛堿增長量最高在4-5月份,達10.47mg/g;二年生金釵石斛莖在4-6月份,石斛堿含量由0.33%增長到0.43%。6月份一年生莖中石斛堿含量是二年生的2倍多。(3)石斛堿具有轉(zhuǎn)移的特性。二年生金釵石斛莖中石斛堿積累量呈“降低—升高—降低—升高”波動性變化,2個降低過程正是新芽形成萌發(fā)的過程,石斛堿向幼嫩組織轉(zhuǎn)移;石斛堿積累量的2次升高過程,是幼嫩組織產(chǎn)生的石斛堿和植株葉片脫落前自身石斛堿,向貯藏器官莖的轉(zhuǎn)移。4月下旬-8月下旬是一年生金釵石斛旺盛生長期,在4月下旬-6月下旬是石斛堿迅速積累期,6月下旬-8月下旬是干物質(zhì)迅速積累期,單位干物質(zhì)石斛堿含量降低。表明石斛堿具有向幼嫩組織(生長點)或貯藏器官轉(zhuǎn)移的特性。(4)一年生金釵石斛干物質(zhì)和石斛堿積累量與分配與二年生截然不同。一年生金釵石斛整枝干物質(zhì)積累量呈“S”變化,可用Logistic方程擬合,8月份前葉片生長占主體,8月份后進行莖干物質(zhì)積累;而二年生干物質(zhì)整枝積累量總體呈遞減變化,莖干物質(zhì)積累量整個生育期變化不大。一年生金釵石斛進行營養(yǎng)生長,而二年生金釵石斛進行無性繁殖生長。一年生金釵石斛莖中石斛堿含量變化大,變化范圍0.22%-0.97%,莖石斛堿積累量總體呈“快—慢—快”的增長趨勢,莖石斛堿分配率始終大于葉片;1月份和12月份二年生金釵石斛石斛堿含量和積累量均差異不大,莖石斛堿分配率始終高于葉片。一年生金釵石斛干物質(zhì)積累量與整枝、莖和葉中石斛堿積累量呈極顯著正相關。(5)通過構(gòu)建金釵石斛轉(zhuǎn)錄組文庫,獲得79,436個Unigene,平均長度是780 nt,有55,393條Unigene被注釋到Nr,Nt,Swiss Port,KEGG,COG,G O六個公共數(shù)據(jù)庫,占總Unigene的69.73%。有30,061個Unigene序列被注釋到128條KEGG代謝途徑,代謝通路分析顯示,有426條基因參與萜類化合物骨架生物合成(ko00900)路徑,有28條基因參與倍半萜和三萜類化合物的生物合成(ko00909)路徑。(6)構(gòu)建了石斛堿含量具有顯著差異的4個時期數(shù)字基因表達譜文庫,以金釵石斛轉(zhuǎn)錄組序列為參考基因組,對表達譜文庫進行分析。6月和10月、9月、8月間DEG數(shù)量分別是2482、2332和1487個,均表現(xiàn)下調(diào)基因大于上調(diào)基因;8月與9月、10月,9月與10月間DEG數(shù)量分別是,1361,1614和1619個,均表現(xiàn)上調(diào)基因大于下調(diào)基因。而后對樣本之間的差異基因進行了表達模式聚類分析、GO功能富集分析和代謝路徑富集分析。綜合4個DGE代謝路徑富集分析顯示17條基因參與了萜類化合物骨架生物合成路徑,2條參與了倍半萜和三萜類化合物的生物合成路徑。(7)篩選了5個參與石斛堿代謝途徑的關鍵酶基因,分別是甲羥戊酸激酶基因(Unigene1219),賴氨酸甲基化酶基因(CL429),異戊烯二磷酸異構(gòu)酶基因(CL3435),法尼基轉(zhuǎn)移酶基因(CL11407)和半胱氨酸甲基酯酶基因(CL8067),通過實時熒光定量PCR定量表達對RNA-Seq差異表達基因的表達量進行驗證,發(fā)現(xiàn)兩種方法測定的DEG表達變化相似,決定系數(shù)R2為0.4666,相關性達到極顯著水平。石斛堿生物合成途徑先按照萜類化合物形成的共同途徑至單萜(萜類形成的共同前體途徑即甲羥戊酸(MVA)途徑和2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸(MEP)途徑),再按照倍半萜途徑進行生物合成。本文從金釵石斛石斛堿含量、積累量及干物質(zhì)積累基本的生長生理過程進行研究,發(fā)現(xiàn)了石斛堿含量差異變化顯著的時期和部位,借助了轉(zhuǎn)錄組和數(shù)字基因表達譜的手段,開展石斛堿代謝研究,提出了石斛堿生物合成的途徑—萜類途徑,為石斛堿生物合成路徑的研究指明了方向,并為其它萜類生物堿研究及金釵石斛中其它次生代謝物研究提供了平臺。
【圖文】：
虛線表示由多步反應完成圖 1-1 植物生物堿類生物合成的三條途徑Fig.1-1 Three ways of plant alkaloids biosynthesis在已經(jīng)知道的植物類生物堿的代謝途徑中，其生物的代謝途徑一般都受到在地區(qū)性、時空性和高度特異酶影響底物的調(diào)控。例如生物堿文多靈的生物合成過程在液泡膜、液泡、體膜、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等 5 個以上細胞結(jié)構(gòu)部位完成小檗堿成橋酶、托品酮還原酶、金黃紫堇堿-6-O-甲基轉(zhuǎn)移酶等專一性酶催化合成一些特定結(jié)構(gòu)物質(zhì)進而生物合成生物堿。而氧化還原酶、脫氫脫羧酶、羥化羧化酶等對合成的底物無嚴格要求，但是底物的不同導致生物合成的最終產(chǎn)物類型存在很大差異。植物的次生代謝調(diào)控一般都涉及很多條基因及其對應的酶的相互協(xié)同的表達。其關鍵酶的基因增強了轉(zhuǎn)錄因子或者基因數(shù)量被調(diào)節(jié)，都可使得植物的次生代謝的多個 Gene 的共同表達，促進了次生代謝產(chǎn)物的生成，也是植物的次生代謝的新方法。目前關于石斛堿代謝途徑研究僅見托品酮還原酶參與石斛堿代謝，，2011 年朱勝男對
技術路線
【學位授予單位】：貴州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S567.239
【參考文獻】
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本文編號：
2628509
