【摘要】：花青素是植物體內(nèi)重要次生代謝產(chǎn)物,植物生長(zhǎng)發(fā)育過程及響應(yīng)生物或非生物脅迫中有著重要作用。本研究通過設(shè)計(jì)花青素合成途徑中結(jié)構(gòu)基因(PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3’H、F3’5’H、DFR、ANS和UF3GT)和調(diào)節(jié)基因(AN1)的特異性引物,從國(guó)外2號(hào)(SWS2)和閩薯一號(hào)(M1)葉片中篩選出差異表達(dá)基因F3H和DFR進(jìn)行克隆及功能分析,并且通過對(duì)調(diào)節(jié)基因AN1的克隆及功能分析,解析馬鈴薯花青素合成的分子機(jī)理。并分析其在馬鈴薯不同品種不同組織中的表達(dá)及花青素含量,為解析馬鈴薯花青素合成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1、用半定量PCR從SWS2和M1葉中篩選出差異表達(dá)基因F3H、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT。用qRT-PCR分析結(jié)構(gòu)基因在不同品種不同組織的表達(dá),結(jié)果顯示:結(jié)構(gòu)基因在SWS2各組織(根、莖、葉、匍匐莖、薯皮、薯肉)中的表達(dá)均高于M1各組織的,且結(jié)構(gòu)基因在不同組織均有表達(dá)差異。SWS2和M1各組織(根、莖、葉、匍匐莖、薯皮、薯肉)的花青素含量結(jié)果顯示:SWS2各組織的明顯高于M1各組織,并且兩品種中花青素含量從低到高依次為根、匍匐莖、莖、葉、薯肉、薯皮。2、通過同源克隆技術(shù),從SWS2和M1中克隆了StF3H基因,兩品種間的基因序列一樣,CDS為1077bp,編碼358個(gè)氨基酸。StF3H基因的蛋白由α-螺旋,β-折疊,延伸主鏈和無規(guī)則卷曲,且無規(guī)則卷曲為主,β-折疊最少。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明與野生馬鈴薯,番茄的親緣關(guān)系比較近,跟圓葉葡萄和煙草的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。通過序列表明StF3H基因與煙草、燈盞草、喬木獼猴桃、番茄的序列相似性比較高,分別達(dá)到89%、91%、92%、97%。qRT-PCR分析顯示,StF3H基因在匍匐莖中表達(dá)量最高,在根中的表達(dá)量最低,表達(dá)量由低到高分別為:根、薯肉、薯皮、葉、莖、匍匐莖。利用Gateway技術(shù)將獲得表達(dá)載體pJAM1502-StF3H。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)StF3H基因的煙草陽(yáng)性苗48株。3、通過同源克隆技術(shù),從SWS2和M1中克隆了StDFR基因,兩品種間的基因序列一樣,CDS為1149bp,編碼382個(gè)氨基酸。StDFR基因的蛋白由α-螺旋,β-折疊,延伸主鏈和無規(guī)則卷曲,且無規(guī)則卷曲為主,β-折疊最少。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明與辣椒、番茄的親緣關(guān)系最近,與矮牽牛、煙草等蛋白的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。通過序列表明StDFR與矮牽牛、茄子、杜鵑、番茄的蛋白序列相似性比較高,分別達(dá)到89%、92%、93%、97%。qRT-PCR分析顯示,StDFR基因在匍匐莖中表達(dá)量最高,在葉中的表達(dá)量最低,表達(dá)量由低到高分別為:根、薯肉、薯皮、葉、莖、匍匐莖。利用Gateway技術(shù)將獲得表達(dá)載體pJAM1502-StDFR。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)StDFR基因的煙草陽(yáng)性苗25株。4、通過同源克隆技術(shù),從SWS2和M1中克隆了StAN1基因,兩品種間的基因序列一樣,該基因CDS為774 bp,編碼了258個(gè)氨基酸。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn),StAN1與辣椒、茄子、蘆竹的親緣關(guān)系最近,與矮牽牛、蘋果等的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。qRT-PCR分析顯示,StAN1基因在兩品種中的表達(dá)量呈現(xiàn)一致,薯皮中的表達(dá)量最高,根中的表達(dá)量最低,其表達(dá)量從低到高依次為根、莖葉、匍匐莖、薯肉、薯皮。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草及馬鈴薯發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)入StAN1基因的煙草,其整個(gè)植株顏色由綠色變成紫色,轉(zhuǎn)基因馬鈴薯愈傷組織變紫。轉(zhuǎn)StAN1基因的煙草花青素含量為20 mg/L FW,野生型煙草中的花青素含量為2 mg/L FW,該結(jié)果表明StAN1基因與花青素的合成有關(guān)。
【圖文】：

MW (分子量) =摩爾質(zhì)量 449.2 g/mol；DF 為稀釋因子；103是將單位 g 換算為 mg；ε 為消光系數(shù)= 26 900 L × mol-1× cm-1；l = 比色杯厚度，cm。2.4 結(jié)果與分析2.4.1 SWS2 和 M1 中差異基因的獲取提取馬鈴薯 SWS2 和 M1 葉片的 RNA,反轉(zhuǎn)為 CDNA,以其為模板擴(kuò)增結(jié)構(gòu)基因，電泳圖如下所示（圖 2.1）。合成馬鈴薯花青素的結(jié)構(gòu)基因 PAL、C4H、4Cl、CHS、CHI、F3’H 在 SWS2 和 M1 葉中表達(dá)水平無明顯的差異，F(xiàn)3H、DFR、F3’5’H、ANS、UFGT 的表達(dá)有明顯的差異。表達(dá)有差異的基因都是花青素合成后期的幾個(gè)關(guān)鍵酶，并且有條帶的粗細(xì)及顏色的深淺可以看出 SWS2 中的表達(dá)量明顯高于M1 中的。

圖 2.2 結(jié)構(gòu)基因在 SWS2 和 M1 各組織的表達(dá)Fig. 2.2 Expression of structural genes in SWS2 and M12.4.3 SWS2 和 M1 各組織花青素含量測(cè)定的分析SWS2 和 M1 的各組織（根、莖、葉、匍匐莖，，薯皮、薯肉）進(jìn)行花青素含量的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在薯皮和薯肉中兩者的花青素含量都是最高的（圖 2.3）。SWS2中，薯皮中花青素的含量最高達(dá)到 0.3 mg/L ,根最低含有 0.067mg/L，從低到高依次為根、匍匐莖、莖、葉、薯肉、薯皮。M1 中薯皮中花青素含量最高為 0.06 mg/L,根中花青素含量最低為 0.017 mg/L，從低到高依次為根、匍匐莖、莖、葉、薯肉、薯皮。0.150.20.250.30.35（g/mL）WFSWS2
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S532

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本文編號(hào)：2624406