【摘要】：大豆(Glycine max)原產(chǎn)于我國,是世界范圍內(nèi)主要油料作物之一。由于大豆轉(zhuǎn)基因效率較低,病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)已成為在大豆上研究基因功能的關(guān)鍵技術(shù)之一。大豆花葉病毒(Soybean mosaic viruss,SMV)病是一種全球性大豆病毒病害,廣泛分布于我國各大豆主產(chǎn)區(qū),嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量與品質(zhì)。SMV常引發(fā)大豆葉片表現(xiàn)花葉和壞死兩種癥狀。通過蛋白組學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)抗壞血酸過氧化物酶(APX)在表現(xiàn)壞死癥狀的細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白在SMV引發(fā)大豆葉片癥狀中的功能,本研究利用VIGS技術(shù)沉默了大豆內(nèi)源APX基因。所用兩個(gè)VIGS載體均以菜豆豆莢斑駁病毒(BPMV)為基礎(chǔ)構(gòu)建,其中r-BPMV載體為RNA載體,需將RNA轉(zhuǎn)錄為DNA才能接種,而p-BPMV載體為DNA載體可直接接種,兩個(gè)載體的主要區(qū)別是后者不需要體外轉(zhuǎn)錄過程。通過克隆APX基因保守序列的基因片段,并分別連接入兩個(gè)BPMV載體中。通過人工摩擦接種方式,使重組載體轉(zhuǎn)入大豆中,分析基因沉默效率,觀察基因沉默植株接種SMV后癥狀表現(xiàn),明確APX基因在大豆抗大豆花葉病毒中的作用。結(jié)果表明,r-BPMV載體構(gòu)建成功,但接種到葉片后葉片未表現(xiàn)花葉癥狀,并且未檢測(cè)到大豆花葉病毒外殼蛋白(CP)基因的表達(dá)。可能是載體的體外轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定導(dǎo)致重組載體沒有有效的侵入植物;p-BPMV載體構(gòu)建成功,接種到兩個(gè)大豆品種(南農(nóng)1138-2和浙A8901)后葉片均表現(xiàn)花葉癥狀,并檢測(cè)到大豆花葉病毒CP基因的表達(dá)。通過qRT-PCR檢測(cè)基因沉默植株APX基因表達(dá)量,結(jié)果顯示,基因沉默植株APX表達(dá)量比接種BPMV空載體(陽性對(duì)照)及接種PBS緩沖液(陰性對(duì)照)低。證明接種重組載體對(duì)沉默內(nèi)源基因有一定效果。兩個(gè)大豆品種的基因沉默植株接種SMV后的癥狀與接種BPMV空載體的陽性對(duì)照無顯著差異,對(duì)接種病毒后CP基因表達(dá)量的qRT-PCR及ELISA分析結(jié)果表明,CP基因在個(gè)別時(shí)間點(diǎn)上調(diào)表達(dá)。以上結(jié)果表明APX基因?qū)MV引發(fā)大豆花葉癥狀的表現(xiàn)沒有促進(jìn)作用。綜上所述,試驗(yàn)結(jié)果證明r-BPMV載體由于體外轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定,不能有效沉默內(nèi)源基因,p-BPMV沉默載體對(duì)沉默內(nèi)源基因有一定效果。
【圖文】：

圖１－１病毒誘導(dǎo)的基因沉默原理圖［３５］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．邋１－１邋Ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｇｅｎｅ邋ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ逡逑３逡逑

Ｓｅｑ＿２ｔＧＧＣＥＡＣＭＴＡＴＡＡＣＧＡＧＧＴＧＣＡＡＧ邋９８０逡逑圖２－２邋ｒ＿ＢＰＭＶ重組載體與目的基因核苷酸序列比對(duì)分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｒ－ＢＰＭＶ邋ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ａｎｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔａｒｇｅｔ逡逑ｇｅｎｅ逡逑注：ＳｅｑＪ表示目的基因序列，Ｓｅｑ＿２表示ｒ－ＢＰＭＶ重組載體基因序列。逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｓｅｑ＿ｌ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｇｅｎｅ，邋ａｎｄ邋Ｓｅｑ＿２邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ逡逑
【學(xué)位授予單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S565.1

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本文編號(hào)：2606773