煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)病是蔬菜等作物上的重要病害,目前缺乏有效的防治措施,RNA干擾(RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為病毒病害防治提供了新思路。研究表明,基于病毒基因的外源雙鏈RNA(dsRNA)可以在植物體內(nèi)誘導(dǎo)RNAi,但dsRNA易降解、作用時(shí)間有限,限制了這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。本文以TMV衣殼蛋白(coat protein,CP)基因?yàn)槟康钠?構(gòu)建了TMV CP基因的原核表達(dá)載體,通過(E.coli)HT115(RNaseIII缺陷)菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)得到dsRNA;同時(shí)體外合成dsRNA,并將合成的dsRNA分別與殼聚糖(Chitosan,CS)、層狀雙氫氧化物(layered double hydroxide,LDH)兩種納米材料進(jìn)行融合,形成CS-dsRNA、LDH-dsRNA兩種RNAi制劑,測(cè)試其穩(wěn)定性結(jié)果表明:在4℃、25℃、37℃,30 d穩(wěn)定性測(cè)定試驗(yàn)中,dsRNA的量較初始值分別減少了80.01%、58.89%和59.76%,降解比較明顯,dsRNA在4℃的降解速率略高于在25℃和37℃的降解速率;CS-dsRNA制劑中dsRNA的量較...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 煙草花葉病毒研究概況
        1.1 煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.2 煙草花葉病毒粒子形態(tài)和基因組結(jié)構(gòu)
        1.3 煙草花葉病毒病的研究進(jìn)展
        1.4 煙草花葉病毒病的防治
    2 納米材料的簡(jiǎn)介
        2.1 納米材料的定義
        2.2 納米材料的分類
        2.3 納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響
            2.3.1 納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的促進(jìn)作用
            2.3.2 納米材料對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的抑制作用
        2.4 納米材料在分子生物學(xué)方面的研究應(yīng)用
    3 RNAi研究進(jìn)展概述
        3.1 RNAi的簡(jiǎn)介
        3.2 RNAi的作用機(jī)制
        3.3 RNAi的特點(diǎn)
        3.4 RNAi技術(shù)在防治植物病毒病方面的應(yīng)用
            3.4.1 病毒基因體外轉(zhuǎn)錄的dsRNA誘導(dǎo)植物產(chǎn)生RNAi
            3.4.2 轉(zhuǎn)入病毒病原dsRNA表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植物
            3.4.3 體外合成的dsRNA轉(zhuǎn)入靶標(biāo)植物誘導(dǎo)產(chǎn)生RNAi
    4 研究的目的和意義
第二章 TMV CP基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建和dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)
    1 材料
        1.1 菌株與載體
        1.2 酶與試劑
        1.3 儀器與設(shè)備
        1.4 引物
    2 常規(guī)DNA分子操作技術(shù)
        2.1 RNA的提取
            2.1.1 硅粒吸附法提取病毒RNA
            2.1.2 Trizol法提取植物RNA
        2.2 cDNA的合成
        2.3 PCR反應(yīng)
        2.4 電泳
        2.5 DNA的純化回收
            2.5.1 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒
            2.5.2 DNA的割膠回收試劑盒
        2.6 DNA的連接
        2.7 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌
        2.8 轉(zhuǎn)化后對(duì)重組子陽(yáng)性情況的篩選與鑒定
            2.8.1 菌落PCR篩選陽(yáng)性重組子
            2.8.2 質(zhì)粒提取(堿裂解法)
            2.8.3 質(zhì)粒提取(試劑盒)
            2.8.4 質(zhì)粒的純化與濃縮
        2.9 重組質(zhì)粒酶切鑒定
        2.10 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定
    3 pLitmus28i原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1 酶切pLitmus28i載體
        3.2 酶切目的片段
        3.3 酶切產(chǎn)物的回收
        3.4 28i載體與目的片段連接轉(zhuǎn)化
        3.5 感受態(tài)細(xì)胞的制備方法
        3.6 目的片段轉(zhuǎn)入大腸桿菌HT115
        3.7 質(zhì)粒的提取
        3.8 重組質(zhì)粒的PCR鑒定
        3.9 重組質(zhì)粒酶切鑒定
        3.10 電泳檢測(cè)
        3.11 重組質(zhì)粒測(cè)序鑒定
    4 dsRNA的誘導(dǎo)表達(dá)
        4.1 dsRNA的誘導(dǎo)
        4.2 CTAB法提取dsRNA
        4.3 Trizol法提取dsRNA
    5 結(jié)果與分析
        5.1 TMV-CP-T載體的構(gòu)建及表達(dá)
        5.2 TMV-CP-28i載體的構(gòu)建及表達(dá)
        5.3 TMV-CP基因誘導(dǎo)表達(dá)dsRNA
    6 結(jié)論與討論
第三章 體外合成的TMV CP基因dsRNA與納米材料的融合
    1 材料
        1.1 供試材料
        1.2 酶與試劑
        1.3 儀器與設(shè)備
        1.4 引物
        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA
            2.1.1 模板的制備
            2.1.2 體外合成dsRNA
        2.2 納米材料-ds RNA的合成
            2.2.1 CS-dsRNA的融合[40]
            2.2.2 LDH-dsRNA的融合
        2.3 納米材料-RNAi制劑穩(wěn)定性測(cè)定
    3 結(jié)果與分析
        3.1 體外合成dsRNA
        3.2 納米材料-ds RNA制劑的研制
        3.3 納米材料-ds RNA制劑吸附穩(wěn)定性的測(cè)定
        3.4 結(jié)論與討論
第四章 RNAi制劑對(duì)TMV的預(yù)防和治療試驗(yàn)
    1 材料
        1.1 供試材料
            1.1.1 供試菌株
            1.1.2 供試納米材料-RNAi制劑
            1.1.3 供試植物
            1.1.4 供試制劑
        1.2 試劑
        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 納米材料-ds RNA制劑對(duì)煙草花葉病毒的預(yù)防和治療試驗(yàn)
            2.1.1 預(yù)防試驗(yàn)
            2.1.2 治療試驗(yàn)
    3 試驗(yàn)結(jié)果
    4 結(jié)論與討論
第五章 全文主要結(jié)論及創(chuàng)新點(diǎn)
    1 全文主要結(jié)論
    2 全文主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
附錄1 本試驗(yàn)所用重要縮寫詞及中文對(duì)照
附錄2 本試驗(yàn)所用溶液及培養(yǎng)基的配方
附錄3 常用生化試劑及儀器



本文編號(hào)：4035973