煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)病是蔬菜等作物上的重要病害,目前缺乏有效的防治措施,RNA干擾(RNAi)技術的出現(xiàn)為病毒病害防治提供了新思路。研究表明,基于病毒基因的外源雙鏈RNA(dsRNA)可以在植物體內誘導RNAi,但dsRNA易降解、作用時間有限,限制了這項技術的應用。本文以TMV衣殼蛋白(coat protein,CP)基因為目的片段,構建了TMV CP基因的原核表達載體,通過(E.coli)HT115(RNaseIII缺陷)菌株進行誘導表達得到dsRNA;同時體外合成dsRNA,并將合成的dsRNA分別與殼聚糖(Chitosan,CS)、層狀雙氫氧化物(layered double hydroxide,LDH)兩種納米材料進行融合,形成CS-dsRNA、LDH-dsRNA兩種RNAi制劑,測試其穩(wěn)定性結果表明:在4℃、25℃、37℃,30 d穩(wěn)定性測定試驗中,dsRNA的量較初始值分別減少了80.01%、58.89%和59.76%,降解比較明顯,dsRNA在4℃的降解速率略高于在25℃和37℃的降解速率;CS-dsRNA制劑中dsRNA的量較...

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 文獻綜述
    1 煙草花葉病毒研究概況
        1.1 煙草花葉病毒的發(fā)現(xiàn)
        1.2 煙草花葉病毒粒子形態(tài)和基因組結構
        1.3 煙草花葉病毒病的研究進展
        1.4 煙草花葉病毒病的防治
    2 納米材料的簡介
        2.1 納米材料的定義
        2.2 納米材料的分類
        2.3 納米材料對植物生長發(fā)育的影響
            2.3.1 納米材料對植物生長發(fā)育的促進作用
            2.3.2 納米材料對植物生長發(fā)育的抑制作用
        2.4 納米材料在分子生物學方面的研究應用
    3 RNAi研究進展概述
        3.1 RNAi的簡介
        3.2 RNAi的作用機制
        3.3 RNAi的特點
        3.4 RNAi技術在防治植物病毒病方面的應用
            3.4.1 病毒基因體外轉錄的dsRNA誘導植物產(chǎn)生RNAi
            3.4.2 轉入病毒病原dsRNA表達載體的轉基因植物
            3.4.3 體外合成的dsRNA轉入靶標植物誘導產(chǎn)生RNAi
    4 研究的目的和意義
第二章 TMV CP基因原核表達載體的構建和dsRNA的誘導表達
    1 材料
        1.1 菌株與載體
        1.2 酶與試劑
        1.3 儀器與設備
        1.4 引物
    2 常規(guī)DNA分子操作技術
        2.1 RNA的提取
            2.1.1 硅粒吸附法提取病毒RNA
            2.1.2 Trizol法提取植物RNA
        2.2 cDNA的合成
        2.3 PCR反應
        2.4 電泳
        2.5 DNA的純化回收
            2.5.1 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒
            2.5.2 DNA的割膠回收試劑盒
        2.6 DNA的連接
        2.7 連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌
        2.8 轉化后對重組子陽性情況的篩選與鑒定
            2.8.1 菌落PCR篩選陽性重組子
            2.8.2 質粒提取(堿裂解法)
            2.8.3 質粒提取(試劑盒)
            2.8.4 質粒的純化與濃縮
        2.9 重組質粒酶切鑒定
        2.10 重組質粒測序鑒定
    3 pLitmus28i原核表達載體的構建
        3.1 酶切pLitmus28i載體
        3.2 酶切目的片段
        3.3 酶切產(chǎn)物的回收
        3.4 28i載體與目的片段連接轉化
        3.5 感受態(tài)細胞的制備方法
        3.6 目的片段轉入大腸桿菌HT115
        3.7 質粒的提取
        3.8 重組質粒的PCR鑒定
        3.9 重組質粒酶切鑒定
        3.10 電泳檢測
        3.11 重組質粒測序鑒定
    4 dsRNA的誘導表達
        4.1 dsRNA的誘導
        4.2 CTAB法提取dsRNA
        4.3 Trizol法提取dsRNA
    5 結果與分析
        5.1 TMV-CP-T載體的構建及表達
        5.2 TMV-CP-28i載體的構建及表達
        5.3 TMV-CP基因誘導表達dsRNA
    6 結論與討論
第三章 體外合成的TMV CP基因dsRNA與納米材料的融合
    1 材料
        1.1 供試材料
        1.2 酶與試劑
        1.3 儀器與設備
        1.4 引物
        1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2 試驗方法
        2.1 體外轉錄合成dsRNA
            2.1.1 模板的制備
            2.1.2 體外合成dsRNA
        2.2 納米材料-ds RNA的合成
            2.2.1 CS-dsRNA的融合[40]
            2.2.2 LDH-dsRNA的融合
        2.3 納米材料-RNAi制劑穩(wěn)定性測定
    3 結果與分析
        3.1 體外合成dsRNA
        3.2 納米材料-ds RNA制劑的研制
        3.3 納米材料-ds RNA制劑吸附穩(wěn)定性的測定
        3.4 結論與討論
第四章 RNAi制劑對TMV的預防和治療試驗
    1 材料
        1.1 供試材料
            1.1.1 供試菌株
            1.1.2 供試納米材料-RNAi制劑
            1.1.3 供試植物
            1.1.4 供試制劑
        1.2 試劑
        1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
    2 試驗方法
        2.1 納米材料-ds RNA制劑對煙草花葉病毒的預防和治療試驗
            2.1.1 預防試驗
            2.1.2 治療試驗
    3 試驗結果
    4 結論與討論
第五章 全文主要結論及創(chuàng)新點
    1 全文主要結論
    2 全文主要創(chuàng)新點
參考文獻
致謝
作者簡介
附錄1 本試驗所用重要縮寫詞及中文對照
附錄2 本試驗所用溶液及培養(yǎng)基的配方
附錄3 常用生化試劑及儀器



本文編號：4035973