從蘋果寄主上分離得到了蘋果莖溝病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)中國株系。經(jīng)基因克隆,測序后發(fā)現(xiàn)蘋果莖溝病毒中國株系外殼蛋白基因(coat protein,CP)含有714個核苷酸,編碼表達(dá)由237氨基酸殘基組成的27 ku蛋白。通過構(gòu)建含有ASGV-CP基因的重組表達(dá)載體pECASGV-CP,在大腸桿菌BL21 (DE3)中成功表達(dá)ASGV-CP蛋白。SDS-PAGE顯示其分子質(zhì)量與預(yù)計大小一致。利用純化的重組蛋白制備多克隆抗體。該抗體可用于Western blot和DAS-ELISA檢測技術(shù)�；谘鍖W(xué)檢測,發(fā)現(xiàn)陜西蘋果主產(chǎn)區(qū)ASGV發(fā)生普遍。

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圖1ASGVCP原核表達(dá)分析

將pECASGV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE分析表明:與陰性對照比較,含有pE-ASGV-CP的BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo),在35ku處出現(xiàn)預(yù)期的特異性蛋白表達(dá)條帶。在37℃培養(yǎng)條件下,誘導(dǎo)后2h即出現(xiàn)特異性條帶,誘導(dǎo)4h和6h后該條帶....

圖2ASGVCP過柱純化

圖1ASGVCP原核表達(dá)分析2.3抗體制備及檢測

圖3ASGVCP抗體WesternBlot分析

以稀釋2000倍的抗血清作為二抗,提取蘋果葉片總蛋白后,采用Westernblot進(jìn)行蛋白雜交分析。結(jié)果顯示,在預(yù)期大小的位置處,所制備抗體能與植物總蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)�？贵w對目標(biāo)蛋白結(jié)合的特異性較好,背景清晰,且與陰性對照沒有特異性反應(yīng)(圖3)。特異性評價:以脫毒組培苗為....

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