目的利用位點(diǎn)特異性重組技術(shù)(FullCoV技術(shù))將中華蜜蜂幼蟲膜蛋白cDNA連接到pPR3-N載體上,構(gòu)建中華蜜蜂幼蟲膜蛋白酵母雙雜交cDNA文庫,利用該文庫,篩選與中蜂囊狀幼蟲病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)結(jié)構(gòu)蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,為進(jìn)一步研究中蜂囊狀幼蟲病毒VP2功能奠定基礎(chǔ)。方法提取2³日齡中蜂幼蟲的總RNA,分離mRNA后,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一鏈的cDNA,并合成雙鏈cDNA。在雙鏈cDNA的5’端加上帶有重組序列的接頭后,通過FullCoV技術(shù)與載體pPR3-N進(jìn)行連接,然后將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞(DH10B),構(gòu)建中蜂幼蟲膜蛋白酵母cDNA文庫,并對該文庫插入片段大小和文庫滴度進(jìn)行檢測。然后,將CSBV VP2基因分別克隆至pBT3STE和pBT3SUC載體,構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2,再將誘餌質(zhì)粒pBT3STE-VP2和pBT3SUC-VP2分別轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)細(xì)胞NMY32中,對其在酵母細(xì)胞中的表達(dá)功能及自激活能力進(jìn)行檢測。在此基礎(chǔ)上,用25 mg的中蜂幼蟲膜...

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

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圖2-1中華蜜蜂幼蟲的總RNAFig.2-1TotalRNAofChinesebeelarvae

圖2-1中華蜜蜂幼蟲的總RNAFig.2-1TotalRNAofChinesebeelarv離，經(jīng)檢測mRNA總量為5.6u

圖2-2中華蜜蜂幼蟲mRNA分離的結(jié)果

圖2-2中華蜜蜂幼蟲mRNA分離的結(jié)果2-2ChinesebeelarvalmRNAisolationr

圖2-3電轉(zhuǎn)化菌涂板后的生長情況

2.2.3文庫滴度的計(jì)算取文庫菌液10μL進(jìn)行稀釋100倍后，取10μL涂于固體培養(yǎng)基上，所構(gòu)建的cDNA文庫平板菌落統(tǒng)計(jì)結(jié)果共長了約300個(gè)克隆子，如圖2-3所示。文庫滴度為3×106cfu/mL。共計(jì)5mL的轉(zhuǎn)化后原始菌液，則總庫容量為：1.5×10....

圖2-4中華蜜蜂幼蟲膜蛋白酵母雙雜交cDNA文庫重組率及插入片段鑒定Fig.2-4RecombinationrateandinsertfragmentidentificationofmembraneproteinyeastcDNAlibraryof

圖2-4中華蜜蜂幼蟲膜蛋白酵母雙雜交cDNA文庫重組率及插入片段鑒ig.2-4RecombinationrateandinsertfragmentidentificationofmembraneproteinyeastApisceranacera....

本文編號：3980204