煙粉虱Bemisiatabaci屬半翅目粉虱科,是一個(gè)包含至少36個(gè)隱存種的物種復(fù)合群。煙粉虱主要通過(guò)傳播雙生病毒對(duì)田間作物造成危害,其中包括番茄黃曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV)等。煙粉虱的暴發(fā)通常伴隨著雙生病毒病的流行。煙粉虱以循環(huán)型方式傳播雙生病毒,傳播過(guò)程中病毒需要經(jīng)過(guò)煙粉虱的腸道、血淋巴以及唾液腺,最終隨唾液一起被分泌至植物中。在傳播過(guò)程中,病毒需要穿過(guò)腸道以及唾液腺的上皮細(xì)胞,這對(duì)病毒的傳播至關(guān)重要。目前對(duì)于病毒跨上皮細(xì)胞運(yùn)輸?shù)难芯恐饕性邳S癥病毒科病毒中,而且研究方法也局限于透射電鏡的觀察。病毒在中腸上皮細(xì)胞的運(yùn)輸機(jī)制還有待進(jìn)一步研究,例如昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)的何種結(jié)構(gòu)、哪些基因幫助病毒完成跨細(xì)胞運(yùn)輸?這種運(yùn)輸方式是否適用于其他循環(huán)型傳播的病毒?為了回答這些問(wèn)題,我們對(duì)雙生病毒在煙粉虱中腸細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的研究,研究結(jié)果如下:(1)雙生病毒在中腸上皮細(xì)胞中的運(yùn)輸依賴于囊泡結(jié)構(gòu)。囊泡結(jié)構(gòu)是一類被磷脂雙分子膜包裹的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),主要...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述及研究目的
    1.1 煙粉虱
    1.2 雙生病毒
        1.2.1 雙生病毒的基因組結(jié)構(gòu)
        1.2.2 菜豆金黃花葉病毒屬(Begomovirus)
        1.2.3 Begomovirus的危害
    1.3 煙粉虱傳播雙生病毒過(guò)程
        1.3.1 媒介昆蟲(chóng)傳播植物病毒的機(jī)制
        1.3.2 煙粉虱傳播雙生病毒的機(jī)制
        1.3.3 煙粉虱中腸對(duì)雙生病毒傳播的影響
        1.3.4 煙粉虱血淋巴對(duì)雙生病毒傳播的影響
        1.3.5 煙粉虱唾液腺對(duì)雙生病毒傳播的影響
    1.4 內(nèi)體以及其他囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)
        1.4.1 細(xì)胞內(nèi)體簡(jiǎn)介
        1.4.2 早期內(nèi)體
        1.4.3 晚期內(nèi)體
        1.4.4 溶酶體
        1.4.5 內(nèi)體的酸化
        1.4.6 內(nèi)體在煙粉虱-雙生病毒中的研究現(xiàn)狀
    1.5 泛素化通路
        1.5.1 泛素以及泛素化概述
        1.5.2 泛素化過(guò)程以及所需要的蛋白
        1.5.3 泛素化的方式
        1.5.4 泛素化修飾的作用
        1.5.5 泛素化在病毒與細(xì)胞互作中的研究
    1.6 具有血淋巴毒性的抗蟲(chóng)蛋白
        1.6.1 影響蛋白毒性的因素
        1.6.2 將毒蛋白運(yùn)送至血淋巴的方法
    1.7 本研究的目的及意義
        1.7.1 研究目的
        1.7.2 主要內(nèi)容
2 基本材料與方法
    2.1 供試材料
        2.1.1 供試?yán)ハx(chóng)
        2.1.2 供試植物
        2.1.3 供試病毒
    2.2 主要儀器和試劑
        2.2.1 煙粉虱飼養(yǎng)及生態(tài)實(shí)驗(yàn)
        2.2.2 成像儀器
        2.2.3 分子生物學(xué)相關(guān)儀器
        2.2.4 分子生物學(xué)以及其他試劑
    2.3 常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)
        2.3.1 DNA提取方法
        2.3.2 RNA提取方法以及反轉(zhuǎn)錄
        2.3.3 分子亞克隆
        2.3.4 雙鏈RNA合成
        2.3.5 蛋白質(zhì)原核表達(dá)及蛋白純化
        2.3.6 蛋白質(zhì)電泳與western blot
        2.3.7 定量PCR
        2.3.8 煙粉虱在植物上的適合度檢測(cè)
3 雙生病毒在煙粉虱中腸上皮細(xì)胞中的運(yùn)輸過(guò)程
    3.1 材料與方法
        3.1.1 供試材料
        3.1.2 化學(xué)抑制劑飼喂
        3.1.3 雙鏈RNA合成
        3.1.4 顯微注射dsRNA誘導(dǎo)RNA沉默
        3.1.5 沉默效率檢測(cè)
        3.1.6 煙粉虱獲毒能力檢測(cè)
        3.1.7 煙粉虱蜜露中的糖分檢測(cè)
        3.1.8 煙粉虱傳毒能力檢測(cè)
        3.1.9 免疫熒光
        3.1.10 共聚焦顯微鏡拍攝
        3.1.11 STORM顯微拍攝
        3.1.12 凝集素親和捕捉及質(zhì)譜測(cè)序
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 沉默囊泡運(yùn)輸相關(guān)基因抑制煙粉虱獲取TYLCV
        3.2.2 Brefeldin A抑制煙粉虱獲取TYLCV
        3.2.3 TYLCV在煙粉虱中腸中的亞細(xì)胞定位
        3.2.4 高爾基體不參與TYLCV細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸
        3.2.5 TYLCV可能位于內(nèi)體或溶酶體中
        3.2.6 早期內(nèi)體在TYLCV運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用
        3.2.7 對(duì)病毒及囊泡結(jié)構(gòu)的超高分辨成像
        3.2.8 Snx蛋白家族對(duì)煙粉虱獲取病毒的影響
        3.2.9 早期內(nèi)體對(duì)其他雙生病毒的傳播同樣起重要作用
    3.3 討論
4 泛素-蛋白酶體通路對(duì)煙粉虱傳毒的影響
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試材料
        4.1.2 蛋白濃度測(cè)定
        4.1.3 雙生病毒對(duì)煙粉虱體內(nèi)泛素化的影響
        4.1.4 抑制劑飼喂對(duì)煙粉虱獲取病毒的影響
        4.1.5 蛋白酶體對(duì)煙粉虱獲取病毒的影響
        4.1.6 通過(guò)western bolt及免疫熒光檢測(cè)CP及泛素蛋白
    4.2 結(jié)果
        4.2.1 雙生病毒不影響煙粉虱體內(nèi)泛素化以及蛋白酶體降解的整體活性
        4.2.2 抑制蛋白酶體活性導(dǎo)致煙粉虱體內(nèi)病毒含量升高
        4.2.3 泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可能不直接參與TYLCV的降解
    4.3 討論
5 利用病毒外殼與毒肽融合蛋白開(kāi)發(fā)殺蟲(chóng)毒蛋白
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試材料
        5.1.2 蛋白原核表達(dá)
        5.1.3 蛋白濃度測(cè)定
        5.1.4 顯微注射毒蛋白
        5.1.5 蛋白膜飼喂毒蛋白
        5.1.6 轉(zhuǎn)基因番茄的獲得及對(duì)煙粉虱的影響
    5.2 結(jié)果
        5.2.1 蛋白表達(dá)及濃度測(cè)定
        5.2.2 注射GST-Hv1a蛋白對(duì)煙粉虱的影響
        5.2.3 GST-CP-Hv1a的經(jīng)口毒性
        5.2.4 CP-Hv1a轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)煙粉虱的影響
    5.3 討論
6 總討論
    6.1 全文總結(jié)
    6.2 本研究的特色和創(chuàng)新之處
    6.3 不足之處以及值得繼續(xù)研究的問(wèn)題
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ煙粉虱適應(yīng)煙草過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組分析
    1 材料與方法
        1.1 供試材料
        1.2 煙粉虱對(duì)煙草植物的長(zhǎng)期適應(yīng)
        1.3 測(cè)序樣品準(zhǔn)備
        1.4 基因表達(dá)分析
        1.5 定量驗(yàn)證
        1.6 GO富集分析
        1.7 煙粉虱飛行肌的圖像分析
        1.8 煙草腺毛對(duì)煙粉虱的影響
        1.9 統(tǒng)計(jì)分析方法
    2 結(jié)果
        2.1 煙粉虱可以逐漸適應(yīng)煙草寄主
        2.2 煙粉虱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析
        2.3 基因表達(dá)量分析
        2.4 GO富集分析
        2.5 煙粉虱體型以及飛行肌分析
        2.6 煙草腺毛對(duì)煙粉虱的影響
        2.7 煙粉虱內(nèi)共生菌基因表達(dá)量變化
    3 討論
    附錄參考文獻(xiàn)
附錄Ⅱ 本文所用病毒縮寫(xiě)及中英文對(duì)照
附錄Ⅲ 常用緩沖液及培養(yǎng)基配方



本文編號(hào)：3911487