稻瘟病作為嚴(yán)重的稻類疾病,感染稻類的葉、莖、梗甚至根處,傳播十分迅猛,一旦感染某個地區(qū),再也無法被根治。殺稻瘟菌素對霉菌和酵母菌有良好的抑制活性,防治稻瘟病的效果優(yōu)于有機(jī)汞農(nóng)藥,在日本很快被用于替代制劑防治稻瘟病。目前,殺稻瘟菌素廣泛應(yīng)用于真核細(xì)胞轉(zhuǎn)基因篩選研究中,具有良好的商業(yè)價值。Mark Zabriskie課題組克隆了殺稻瘟菌素的生物合成基因簇,測序并推導(dǎo)了它的生物合成途徑,但由于其原始產(chǎn)生菌無法進(jìn)行遺傳操作,有關(guān)殺稻瘟菌素生物合成基因簇的基因功能所知甚少。殺稻瘟菌素(BS)生物合成過程中檢測到中間代謝產(chǎn)物脫甲基殺稻瘟菌素(DBS)、亮氨酰脫甲基殺稻瘟菌素(LDBS)、亮氨酰殺稻瘟菌素(LBS)。前期研究證明:BS或者DBS被亮氨酰化后,毒性顯著降低,推測亮氨�；巧锖铣蛇^程中一種有效的自我保護(hù)機(jī)制;BS生物合成中的最后一個中間體LBS上的亮氨酸,最終因被水解而成熟為殺稻瘟菌素。本研究主要圍繞鑒定與研究LBS水解酶如何將LBS成熟為BS,以期完善對殺稻瘟菌素生物合成途徑的認(rèn)識,并為其產(chǎn)量提高和組分轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。本研究前期通過染色體步移及對基因簇兩側(cè)可能的水解酶基因進(jìn)行了系列...

【文章頁數(shù)】：172 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 鏈霉菌的異源表達(dá)簡介
    1.2 氨肽酶N簡介
        1.2.1 肽酶簡介
        1.2.2 氨肽酶簡介
        1.2.3 氨肽酶N簡介
    1.3 核苷類抗生素簡介
    1.4 抗性素產(chǎn)生菌的抗性機(jī)制簡介
    1.5 抗性素的隱藏反應(yīng)簡介
    1.6 殺稻瘟菌素生物合成的研究背景
        1.6.1 殺稻瘟菌素簡介
        1.6.2 殺稻瘟菌素的生物合成途徑研究進(jìn)展
        1.6.3 殺稻瘟菌素基因簇的異源表達(dá)
        1.6.4 殺稻瘟菌素原始產(chǎn)生菌的抗性機(jī)制及成熟機(jī)制介紹
    1.7 本研究的內(nèi)容和目的
第二章 材料與方法
    2.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        2.1.1 菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 PCR引物
    2.2 實(shí)驗材料
    2.3 實(shí)驗方法
        2.3.1 菌種的培養(yǎng)及保存
        2.3.2 大腸桿菌質(zhì)粒的提取
        2.3.3 鏈霉菌質(zhì)粒的小量提取
        2.3.4 大腸桿菌總DNA的少量提取
        2.3.5 鏈霉菌總DNA的少量提取
        2.3.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)
        2.3.7 DNA的酶切、回收、連接
        2.3.8 E.coli鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.9 E.coli電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.10 E.coli鈣轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        2.3.11 大腸桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        2.3.12 兩親本雜交介導(dǎo)的質(zhì)粒DNA跨屬轉(zhuǎn)移
        2.3.13 殺稻瘟菌素的液體發(fā)酵
        2.3.14 殺稻瘟菌素發(fā)酵液的純化
        2.3.15 殺稻瘟菌素的生物活性測定
        2.3.16 殺稻瘟菌素發(fā)酵液的高效液相色譜法(HPLC)測定
        2.3.17 HPLC法測定殺稻瘟菌素BS的標(biāo)準(zhǔn)曲線
        2.3.18 細(xì)胞粗提液(CFE)和全細(xì)胞的制備
        2.3.19 LBS水解反應(yīng)體系
        2.3.20 飽和硫酸銨沉淀活性組分
        2.3.21 蛋白質(zhì)LC-MS/MS鑒定
        2.3.22 PCR-targeting的方法敲除大腸桿菌基因組的基因
        2.3.23 PCR-targeting的方法敲除鏈霉菌基因組的基因
        2.3.24 蛋白表達(dá)及純化
        2.3.25 鏈霉菌總RNA的提取(細(xì)胞破碎法)
        2.3.26 鏈霉菌總RNA中基因組DNA的消化
        2.3.27 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        2.3.28 鏈霉菌中基因的過表達(dá)
        2.3.29 利用CRISPR/Cas9-codA(sm)系統(tǒng)敲除鏈霉菌基因組的基因
        2.3.30 Western雜交
        2.3.31 生物信息學(xué)分析
第三章 亮氨酰化殺稻瘟菌素(LBS)水解酶的鑒定
    3.1 前言
    3.2 結(jié)果與討論
        3.2.1 LBS水解酶基因存在于殺稻瘟菌素(BS)基因簇之外
        3.2.2 LBS水解酶基因廣泛存在于微生物中
        3.2.3 在E.coli DH10B中追蹤水解活性組分
        3.2.4 LC-MS/MS數(shù)據(jù)分析出5 個潛在的LBS水解酶
        3.2.5 大場桿菌中的PepN單獨(dú)負(fù)責(zé)水解LBS為 BS
        3.2.6 PepN的體外功能研究
        3.2.7 PepN的穩(wěn)定性研究
第四章 鏈霉菌中多組分LBS水解酶在BS成熟中的作用
    4.1 前言
    4.2 結(jié)果與討論
        4.2.1 生物信息學(xué)功能分析,S.lividans WJ2 中有三個PepN同源蛋白
        4.2.2 PepN1sli是負(fù)責(zé)LBS水解成BS的主要水解酶
        4.2.3 S.lividans WJ2 中,PepN1sli的過表達(dá)能夠提高BS產(chǎn)量
        4.2.4 S.griseochromogenes中三個PepN同源蛋白的活性分析
        4.2.5 S.lividans WJ2 中,三個pepN同源基因的體內(nèi)敲除突變株構(gòu)建
        4.2.6 pepN同源基因缺失突變株的體外水解活性及發(fā)酵驗證
        4.2.7 生物信息學(xué)功能分析及體外活性驗證,PepA具有微弱LBS水解活性
        4.2.8 飽和硫酸銨沉淀的方式對LBS水解酶進(jìn)一步挖掘
第五章 原始產(chǎn)生菌S.griseochromogenes和異源表達(dá)菌S.lividans WJ2中LBS水解酶活性對BS產(chǎn)量及組分的影響
    5.1 前言
    5.2 結(jié)果與討論
        5.2.1 水解酶主組分PepN1 的體外活性差異比較
        5.2.2 水解酶主組分PepN1 的穩(wěn)定性比較
        5.2.3 水解酶主組分PepN1 的體內(nèi)活性差異比較
        5.2.4 發(fā)酵過程中pH值的監(jiān)測
        5.2.5 Western雜交分析PepN1 的體內(nèi)表達(dá)量差異
第六章 殺稻瘟菌素產(chǎn)量的提高
    6.1 前言
    6.2 結(jié)果與討論
        6.2.1 突破生物合成限速步驟,單獨(dú)過表達(dá)基因簇內(nèi)9 個功能基因
        6.2.2 提高前體cytosine供給,單獨(dú)過表達(dá)BlsMF19Y
        6.2.3 提高前體UDP-葡萄糖醛酸供給,單獨(dú)過表達(dá)UDP-葡萄糖脫氫酶
        6.2.4 提高前體Leu-tRNALeu供給,串聯(lián)過表達(dá)Bls J、Bld A及 LRS
        6.2.5 提高中間體LDBS濃度,串聯(lián)過表達(dá)BlsK、BlsJ、BldA及 LRS
第七章 總結(jié)與展望
    7.1 本研究工作總結(jié)
    7.2 本研究主要創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 進(jìn)一步工作和展望
        7.3.1 其它低活性LBS水解酶的鑒定
        7.3.2 Fe²⁺刺激細(xì)胞上的水解酶活性的基因的鑒定
        7.3.3 小分子肽類次級代謝產(chǎn)物異源表達(dá)宿主的驗證
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
附錄



本文編號：3888549