[目的]昆蟲通過靈敏而特異的嗅覺感知周圍環(huán)境中的揮發(fā)性化學(xué)信息物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主植物的識(shí)別和定位、配偶和產(chǎn)卵場(chǎng)所的選擇等。蓮草直胸跳甲Agasicles hygrphila是全球性惡性雜草喜旱蓮子草Alternanthera philoxeroides的專食性天敵。嗅覺是蓮草直胸跳甲專一性識(shí)別寄主植物的關(guān)鍵。氣味結(jié)合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)是參與環(huán)境中化學(xué)信息物質(zhì)識(shí)別的重要嗅覺相關(guān)蛋白。通過異源表達(dá)獲得蓮草直胸跳甲的OBPs有助于研究其對(duì)喜旱蓮子草的識(shí)別和定位進(jìn)而實(shí)現(xiàn)寄主專一性。[方法]通過基因克隆獲得三個(gè)OBP的全長(zhǎng)序列,原核表達(dá)獲得蓮草直胸跳甲OBPs的包涵體蛋白。通過Ni-IDA親和層析進(jìn)行純化,得到可溶的目的蛋白。采用ExPASy-ProtParam對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,利用DNAMAN對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì),利用MEGA5.02采用NJ法構(gòu)建了蓮草直胸跳甲OBPs的進(jìn)化樹。采用qPCR對(duì)蓮草直胸跳甲OBPs在雌雄成蟲不同組織和不同組織同一性別的成蟲中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,采用SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,分別采用One-way A...

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
1 引言
    1.1 昆蟲的嗅覺
    1.2 昆蟲的嗅覺機(jī)制
    1.3 植物揮發(fā)物和昆蟲信息素
        1.3.1 植物揮發(fā)物
        1.3.2 昆蟲信息素
    1.4 氣味結(jié)合蛋白(OBPs)的研究進(jìn)展
        1.4.1 OBPs的發(fā)現(xiàn)
        1.4.2 OBPs的特征
        1.4.3 OBPs的分類
        1.4.4 OBPs的生理功能
        1.4.5 OBPs在其他組織器官中的表達(dá)
        1.4.6 OBPs與配體的結(jié)合特性
        1.4.7 OBPs與配體結(jié)合的研究方法
    1.5 其他嗅覺相關(guān)蛋白
    1.6 研究目的及意義
2 蓮草直胸跳甲OBPs的基因克隆、原核表達(dá)及純化分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 所用載體
        2.1.5 所配試劑
    2.2 試驗(yàn)方法
        2.2.1 蓮草直胸跳甲總RNA的提取
        2.2.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
        2.2.3 目的序列的PCR擴(kuò)增
        2.2.4 PCR產(chǎn)物膠回收
        2.2.5 克隆型載體的構(gòu)建
        2.2.6 轉(zhuǎn)化
        2.2.7 陽(yáng)性重組子的鑒定、測(cè)序和保存
    2.3 蓮草直胸跳甲OBPs生物信息學(xué)分析
    2.4 蓮草直胸跳甲OBPs的表達(dá)模式分析
        2.4.1 供試?yán)ハx及組織收集
        2.4.2 蓮草直胸跳甲各組織總RNA的提取
        2.4.3 cDNA第一條鏈的合成
        2.4.4 引物設(shè)計(jì)
        2.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)
    2.5 蓮草直胸跳甲OBPs原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.5.1 pEASY(?)- Blunt Cloning Vector質(zhì)粒提取
        2.5.2 表達(dá)引物的設(shè)計(jì)
        2.5.3 表達(dá)序列PCR
        2.5.4 PCR產(chǎn)物回收
        2.5.5 轉(zhuǎn)化
        2.5.6 pET28a(+)質(zhì)粒提取
        2.5.7 pET28a(+)雙酶切
        2.5.8 無縫克隆
        2.5.9 轉(zhuǎn)化
        2.5.10 陽(yáng)性克隆鑒定
    2.6 蓮草直胸跳甲OBPs的表達(dá)、純化
        2.6.1 IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
        2.6.2 SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)
        2.6.3 原核表達(dá)蛋白的純化
3 結(jié)果與分析
    3.1 目的序列擴(kuò)增結(jié)果
    3.2 目的序列克隆載體構(gòu)建結(jié)果
    3.3 蓮草直胸跳甲OBPs的生物信息學(xué)分析結(jié)果
        3.3.1 蓮草直胸跳甲OBPs的理化性質(zhì)分析
        3.3.2 蓮草直胸跳甲OBPs的多序列比對(duì)
        3.3.3 蓮草直胸跳甲OBPs的進(jìn)化樹分析
    3.4 表達(dá)模式分析
    3.5 目的序列原核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果
        3.5.1 目的序列表達(dá)引物PCR結(jié)果
        3.5.2 目的序列重組表達(dá)載體的鑒定
    3.6 目的蛋白原核表達(dá)及蛋白純化結(jié)果
        3.6.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.6.2 AhygOBP1的蛋白經(jīng)不同濃度洗雜緩沖液純化
        3.6.3 AhygOBP1的蛋白純化
4 結(jié)論
5 討論
參考文獻(xiàn)
Abstract
致謝



本文編號(hào)：3874799