發(fā)布時間：2023-11-12 18:43

　　大豆作為我國的主要農作物,長年受到生物或非生物脅迫,前人關于鹽堿、干旱等非生物脅迫已有頗多的報道,但有關生物脅迫的研究較少。大豆胞囊線蟲(Soybean Cyst Nematode,簡稱:SCN)病是主要生物脅迫病害之一,侵染植株嚴重。因此,如何防治SCN已逐漸成為科學家研究的重點。傳統(tǒng)的防治方法為輪作或者種植抗病品種,但傳統(tǒng)方法容易導致線蟲產(chǎn)生適應性,因此隨著基因工程技術的發(fā)展,篩選抗性基因并培育抗性植株成為主要防治手段并取得成效。肌醇磷酸合成酶(MIPS)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)生成肌醇-1-磷酸,此步驟為真核生物肌醇合成的限速步驟。肌醇參與植物體中多種代謝途徑,并且與植物細胞壁的生物合成密切相關,肌醇可以通過自身氧化代謝途徑生成參與細胞壁合成的多糖:木聚糖以及果膠。由此推斷,調控MIPS基因的表達水平可增強大豆細胞壁的合成用于抵抗線蟲的侵染。在大豆基因組上發(fā)現(xiàn)MIPS基因,命名為GmMIPS,其基因家族包括四個基因。本試驗選擇抗病品種灰皮支黑豆、哈爾濱小黑豆、小粒黑豆以及感病品種遼豆15,分別在SCN三號生理小種(SCN3)侵染后的不同時間段取樣,提取RNA并反轉錄為c...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 大豆胞囊線蟲簡介
        1.1.1 大豆胞囊線蟲的生活史
        1.1.2 大豆胞囊線蟲線蟲病的危害
        1.1.3 大豆胞囊線蟲的防治
        1.1.4 大豆胞囊線蟲病的抗性機制研究進展
    1.2 肌醇磷酸合成酶(MIPS)簡介
    1.3 肌醇磷酸合成酶基因(MIPS)的簡介
        1.3.1 MIPS基因在線蟲脅迫下的研究
        1.3.2 MIPS基因在非生物脅迫下的研究
    1.4 本課題的主要思路及研究內容
第二章 Gm MIPS1、Gm MIPS2蛋白的生物信息學分析
    2.1 生物信息學分析網(wǎng)址及工具軟件
    2.2 結果與分析
        2.2.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的序列分析
        2.2.2 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白質的理化性質及二級結構分析
        2.2.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白磷酸化位點分析
        2.2.4 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白親水性分析
        2.2.5 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的進化分析
    2.3 本章小結
第三章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因在線蟲脅迫下的表達分析
    3.1 材料
        3.1.1 植株材料
        3.1.2 大豆胞囊線蟲
        3.1.3 試驗試劑
        3.1.4 試驗設備
    3.2 試驗方法
        3.2.1 大豆胞囊線蟲的獲得和處理
        3.2.2 大豆胞囊線蟲的孵育
        3.2.3 供試大豆的處理
        3.2.4 次氯酸鈉-酸性品紅染色
        3.2.5 大豆根部RNA的提取
        3.2.6 RNA濃度和純度的檢測
        3.2.7 RT-PCR獲得c DNA
        3.2.8 Gm MIPS基因熒光定量PCR引物設計
        3.2.9 實時熒光定量PCR操作步驟
    3.3 結果與分析
        3.3.1 SCN3侵染大豆根部后的形態(tài)學觀察-酸性品紅染色結果
        3.3.2 大豆根RNA的提取
        3.3.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因表達曲線的分析
    3.4 本章小結
第四章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因的克隆和載體構建
    4.1 材料
        4.1.1 植株材料
        4.1.2 供試試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基
        4.1.4 試驗設備
    4.2 方法
        4.2.1 引物及酶切位點設計
        4.2.2 引物處理和稀釋
        4.2.3 大豆總RNA的提取
        4.2.4 RNA濃度和純度檢測
        4.2.5 反轉錄c DNA
        4.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因擴增
        4.2.7 PCR產(chǎn)物的純化
        4.2.8 目的基因的膠回收
        4.2.9 回收DNA片段加“A”尾
        4.2.10 目的基因與T-Vector p MD19載體連接
        4.2.11 大腸桿菌轉化
        4.2.12 重組質粒的提取
        4.2.13 轉化結果及重組質粒的鑒定
        4.2.14 目的基因與過表達載體p CAMBIA1303連接轉化
        4.2.15 轉化結果鑒定
    4.3 結果與分析
        4.3.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的克隆
        4.3.2 重組質粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的菌落PCR鑒定
        4.3.3 重組質粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的雙酶切鑒定
        4.3.4 過表達載體p CAMBIA1303的電泳檢測
        4.3.5 重組質粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的菌落PCR鑒定
        4.3.6 重組質粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的雙酶切鑒定
    4.4 本章小結
第五章 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亞細胞定位
    5.1 材料
        5.1.1 植株材料
        5.1.2 菌種和載體
        5.1.3 供試載體和試劑
        5.1.4 培養(yǎng)基
        5.1.5 主要儀器
    5.2 方法
        5.2.1 試劑配制方法
        5.2.2 本生煙植株的培養(yǎng)
        5.2.3 農桿菌感受態(tài)細胞的制備
        5.2.4 瞬時表達載體轉入農桿菌感受態(tài)細胞
        5.2.5 陽性克隆的篩選和鑒定
        5.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亞細胞定位具體步驟
    5.3 結果與分析
    5.4 本章小結
第六章 結論與討論
    6.1 結論
    6.2 討論
參考文獻
致謝
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本文編號：3863727