大豆作為我國(guó)的主要農(nóng)作物,長(zhǎng)年受到生物或非生物脅迫,前人關(guān)于鹽堿、干旱等非生物脅迫已有頗多的報(bào)道,但有關(guān)生物脅迫的研究較少。大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Soybean Cyst Nematode,簡(jiǎn)稱(chēng):SCN)病是主要生物脅迫病害之一,侵染植株嚴(yán)重。因此,如何防治SCN已逐漸成為科學(xué)家研究的重點(diǎn)。傳統(tǒng)的防治方法為輪作或者種植抗病品種,但傳統(tǒng)方法容易導(dǎo)致線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生適應(yīng)性,因此隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,篩選抗性基因并培育抗性植株成為主要防治手段并取得成效。肌醇磷酸合成酶(MIPS)催化葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)生成肌醇-1-磷酸,此步驟為真核生物肌醇合成的限速步驟。肌醇參與植物體中多種代謝途徑,并且與植物細(xì)胞壁的生物合成密切相關(guān),肌醇可以通過(guò)自身氧化代謝途徑生成參與細(xì)胞壁合成的多糖:木聚糖以及果膠。由此推斷,調(diào)控MIPS基因的表達(dá)水平可增強(qiáng)大豆細(xì)胞壁的合成用于抵抗線(xiàn)蟲(chóng)的侵染。在大豆基因組上發(fā)現(xiàn)MIPS基因,命名為GmMIPS,其基因家族包括四個(gè)基因。本試驗(yàn)選擇抗病品種灰皮支黑豆、哈爾濱小黑豆、小粒黑豆以及感病品種遼豆15,分別在SCN三號(hào)生理小種(SCN3)侵染后的不同時(shí)間段取樣,提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為c...

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)簡(jiǎn)介
        1.1.1 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的生活史
        1.1.2 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)線(xiàn)蟲(chóng)病的危害
        1.1.3 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的防治
        1.1.4 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)病的抗性機(jī)制研究進(jìn)展
    1.2 肌醇磷酸合成酶(MIPS)簡(jiǎn)介
    1.3 肌醇磷酸合成酶基因(MIPS)的簡(jiǎn)介
        1.3.1 MIPS基因在線(xiàn)蟲(chóng)脅迫下的研究
        1.3.2 MIPS基因在非生物脅迫下的研究
    1.4 本課題的主要思路及研究?jī)?nèi)容
第二章 Gm MIPS1、Gm MIPS2蛋白的生物信息學(xué)分析
    2.1 生物信息學(xué)分析網(wǎng)址及工具軟件
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的序列分析
        2.2.2 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
        2.2.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白磷酸化位點(diǎn)分析
        2.2.4 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白親水性分析
        2.2.5 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的進(jìn)化分析
    2.3 本章小結(jié)
第三章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因在線(xiàn)蟲(chóng)脅迫下的表達(dá)分析
    3.1 材料
        3.1.1 植株材料
        3.1.2 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)
        3.1.3 試驗(yàn)試劑
        3.1.4 試驗(yàn)設(shè)備
    3.2 試驗(yàn)方法
        3.2.1 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的獲得和處理
        3.2.2 大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的孵育
        3.2.3 供試大豆的處理
        3.2.4 次氯酸鈉-酸性品紅染色
        3.2.5 大豆根部RNA的提取
        3.2.6 RNA濃度和純度的檢測(cè)
        3.2.7 RT-PCR獲得c DNA
        3.2.8 Gm MIPS基因熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)
        3.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR操作步驟
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 SCN3侵染大豆根部后的形態(tài)學(xué)觀察-酸性品紅染色結(jié)果
        3.3.2 大豆根RNA的提取
        3.3.3 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因表達(dá)曲線(xiàn)的分析
    3.4 本章小結(jié)
第四章 Gm MIPS1、Gm MIPS2基因的克隆和載體構(gòu)建
    4.1 材料
        4.1.1 植株材料
        4.1.2 供試試劑
        4.1.3 培養(yǎng)基
        4.1.4 試驗(yàn)設(shè)備
    4.2 方法
        4.2.1 引物及酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)
        4.2.2 引物處理和稀釋
        4.2.3 大豆總RNA的提取
        4.2.4 RNA濃度和純度檢測(cè)
        4.2.5 反轉(zhuǎn)錄c DNA
        4.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因擴(kuò)增
        4.2.7 PCR產(chǎn)物的純化
        4.2.8 目的基因的膠回收
        4.2.9 回收DNA片段加“A”尾
        4.2.10 目的基因與T-Vector p MD19載體連接
        4.2.11 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        4.2.12 重組質(zhì)粒的提取
        4.2.13 轉(zhuǎn)化結(jié)果及重組質(zhì)粒的鑒定
        4.2.14 目的基因與過(guò)表達(dá)載體p CAMBIA1303連接轉(zhuǎn)化
        4.2.15 轉(zhuǎn)化結(jié)果鑒定
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 Gm MIPS1和Gm MIPS2基因的克隆
        4.3.2 重組質(zhì)粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的菌落PCR鑒定
        4.3.3 重組質(zhì)粒p MD19-Gm MIPS1和p MD19-Gm MIPS2的雙酶切鑒定
        4.3.4 過(guò)表達(dá)載體p CAMBIA1303的電泳檢測(cè)
        4.3.5 重組質(zhì)粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的菌落PCR鑒定
        4.3.6 重組質(zhì)粒p CAMBIA1303-Gm MIPS1和p CAMBIA1303-Gm MIPS2的雙酶切鑒定
    4.4 本章小結(jié)
第五章 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亞細(xì)胞定位
    5.1 材料
        5.1.1 植株材料
        5.1.2 菌種和載體
        5.1.3 供試載體和試劑
        5.1.4 培養(yǎng)基
        5.1.5 主要儀器
    5.2 方法
        5.2.1 試劑配制方法
        5.2.2 本生煙植株的培養(yǎng)
        5.2.3 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        5.2.4 瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        5.2.5 陽(yáng)性克隆的篩選和鑒定
        5.2.6 Gm MIPS1和Gm MIPS2蛋白的亞細(xì)胞定位具體步驟
    5.3 結(jié)果與分析
    5.4 本章小結(jié)
第六章 結(jié)論與討論
    6.1 結(jié)論
    6.2 討論
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3863727