植物類病斑突變體在沒有外界病原菌侵染的情況下,能自發(fā)形成類似于過敏性反應的壞死斑,且大多都能增強對病原菌的抗性,是一類研究細胞程序化死亡(PCD)和植物防御機制的理想材料。本研究以水稻類病斑突變體spl33(spotted leaf 33)為材料,通過圖位克隆分離得到一個編碼真核翻譯延伸因子eEF1A(eukaryotic translation elongation factor 1A)的基因SPL33,其功能缺失導致植株細胞壞死和抗性增強。本文主要研究結果如下:1、spl33從3葉期開始,葉片上散生一些小的、紅褐色的壞死斑,隨著葉片生長發(fā)育斑點呈現(xiàn)增多和變大趨勢,且一直持續(xù)到成熟期。經(jīng)過多年多點種植發(fā)現(xiàn),突變體spl33表型穩(wěn)定,屬于自發(fā)的全生育期的擴展型類病斑突變體,其壞死斑點出現(xiàn)的早晚與多少受溫度和光照等外界因素的影響。2、遺傳分析表明,spl33是一個單隱性核基因控制的突變體。利用突變體×Dular雜交的F₂群體中的476個隱性單株將目標基因定位在第1染色體H2和H23之間70 kb的區(qū)間。該區(qū)間包含11個ORFs,測序發(fā)現(xiàn)LOC_O...

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【學位級別】：博士

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摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 植物類病斑突變體的研究進展
        1.1.1 類病斑突變體概述
        1.1.2 類病斑突變體的來源
        1.1.3 類病斑的發(fā)生機制
        1.1.4 類病斑突變體的抗病性
        1.1.5 水稻類病斑基因的克隆
    1.2 eEF1A蛋白的研究進展
        1.2.1 eEF1A參與細胞凋亡過程
        1.2.2 eEF1A參與蛋白降解過程
        1.2.3 eEF1A參與調控細胞骨架系統(tǒng)
        1.2.4 eEF1A參與細胞核物質輸出
    1.3 本研究的目的及意義
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 水稻材料
        2.1.2 病原菌株
        2.1.3 載體質粒、大腸桿菌、農(nóng)桿菌和酵母菌株
        2.1.4 實驗試劑
    2.2 實驗方法
        2.2.1 田間種植
        2.2.2 表型及農(nóng)藝性狀考察
        2.2.3 光照和溫度處理
        2.2.4 花器官形態(tài)及花粉活力觀察
        2.2.5 基因定位群體構建
        2.2.6 水稻基因組DNA提取
        2.2.7 分子標記的開發(fā)及檢測
        2.2.8 基因的定位
        2.2.9 候選基因的序列分析
        2.2.10 互補載體構建
        2.2.11 過表達載體構建
        2.2.12 農(nóng)桿菌介導的水稻遺傳轉化
        2.2.13 序列比對分析
        2.2.14 RNA提取和qRT-PCR分析
        2.2.15 GUS活性的組織化學染色分析
        2.2.16 亞細胞定位
        2.2.17 光合色素含量的測定
        2.2.18 葉綠體透射電鏡觀察
        2.2.19 組織化學分析
        2.2.20 抗病性鑒定
        2.2.21 基因表達譜分析
        2.2.22 酵母雙雜交實驗
第三章 結果與分析
    3.1 類病斑突變體spl33表型鑒定
        3.1.1 突變體spl33形態(tài)觀察
        3.1.2 農(nóng)藝性狀調查
        3.1.3 突變體spl33表型受溫度和光照影響
        3.1.4 突變體spl33花器官和花粉育性的觀察
    3.2 類病斑突變體SPL33基因定位
        3.2.1 突變體spl33的遺傳分析
        3.2.2 突變體SPL33基因的初定位
        3.2.3 突變體SPL33基因的精細定位
    3.3 SPL33基因的克隆
        3.3.1 SPL33基因的互補驗證
        3.3.2 SPL33基因的過表達分析
    3.4 SPL33基因編碼eEF1A-like蛋白
    3.5 SPL33與同源基因LOC_Os04g50870的關系分析
    3.6 SPL33基因表達分析
    3.7 SPL33蛋白的亞細胞定位
    3.8 SPL33調控活性氧積累和細胞死亡
    3.9 SPL33基因調控葉片早衰
    3.10 SPL33基因調控水稻的防御反應
    3.11 轉錄組分析
        3.11.1 差異表達基因篩選和分析
        3.11.2 轉錄組數(shù)據(jù)驗證
        3.11.3 GO富集分析
        3.11.4 KEGG富集分析
    3.12 酵母雙雜交實驗
        3.12.1 SPL33與 26S蛋白酶復合體亞基在酵母中互作
        3.12.2 SPL33與水稻類病斑RLS1和OsLMS在酵母中互作
        3.12.3 SPL33與其他蛋白在酵母中的互作
第四章 討論
    4.1 SPL33編碼一個eEF1A-like蛋白
    4.2 SPL33功能缺失導致細胞死亡和葉片早衰
    4.3 SPL33功能缺失誘導水稻的防御反應
第五章 結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3860998