發(fā)布時(shí)間：2023-10-21 14:12

　　昆蟲中腸BBMV上的特異性受體蛋白與Bt蛋白結(jié)合是Bt發(fā)揮殺蟲作用的關(guān)鍵,而且特異性受體蛋白發(fā)生基因突變或表達(dá)量顯著改變都可能會(huì)使昆蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性。已有研究結(jié)果表明ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族不僅是Cry1A類蛋白的受體,而且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的突變與害蟲對(duì)Bt產(chǎn)生抗性相關(guān)。本文在獲得了棉鈴蟲ABCC1基因全長的基礎(chǔ)上,對(duì)ABCC1在棉鈴蟲不同組織、不同齡期中的表達(dá)量、ABCC1與Cry2Ab、Cry1Ac在體外結(jié)合特性及ABCC1對(duì)Cry2Ab、Cry1Ac毒力的影響等進(jìn)行了研究。研究結(jié)果可為明確棉鈴蟲ABCC1蛋白在Cry2Ab、Cry1Ac殺蟲機(jī)制中的作用、為合理應(yīng)用Cry2Ab、Cry1Ac用于棉鈴蟲的防治及延緩棉鈴蟲抗性發(fā)展提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:1.利用PCR結(jié)合RACE-PCR克隆了棉鈴蟲ABCC1基因全長,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。ABCC1基因開放閱讀框共4545bp,基因登錄號(hào):Gen Bank KY 796050。共編碼1515個(gè)氨基酸,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量169.75 k Da,等電點(diǎn)6.68;N末端不存在信號(hào)肽;有兩個(gè)較大的膜外區(qū)域,有14個(gè)跨膜結(jié)構(gòu);含兩個(gè)跨膜結(jié)...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 棉鈴蟲危害情況概述
    1.2 Bt菌簡介
        1.2.1 Bt蛋白
        1.2.2 Bt蛋白的殺蟲過程
    1.3 Bt蛋白受體概述
        1.3.1 鈣黏蛋白(CAD)
        1.3.2 堿性磷酸酯酶(ALP)
        1.3.3 氨肽酶(APN)
        1.3.4 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)
        1.3.5 其他受體蛋白
    1.4 Bt蛋白的抗性產(chǎn)生的原因
    1.5 Cry1A和 Cry2A類蛋白受體研究概況
    1.6 Bt抗性治理策略
    1.7 本研究的內(nèi)容、目的和意義
第二章 棉鈴蟲ABCC1 基因克隆及序列分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 供試?yán)ハx
        2.1.2 主要試劑和儀器
        2.1.3 棉鈴蟲中腸RNA的提取
        2.1.4 棉鈴蟲中腸cDNA的合成
        2.1.5 3′RACE及5′RACE模板的合成
        2.1.6 引物的設(shè)計(jì)與合成
        2.1.7 普通PCR反應(yīng)體系及條件
        2.1.8 PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定
        2.1.9 ABCC1 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建
    2.2 結(jié)果分析
        2.2.1 普通PCR及 RACE-PCR結(jié)果
        2.2.2 ABCC1 序列分析
        2.2.3 ABCC1 序列進(jìn)化樹分析
    2.3 討論
第三章 棉鈴蟲ABCC1 基因在不同齡期和組織中的表達(dá)量
    3.1 材料方法
        3.1.1 供試?yán)ハx
        3.1.2 主要試劑和儀器
        3.1.3 取樣與方法
        3.1.4 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成
        3.1.5 熒光定量PCR分析
        3.1.6 數(shù)據(jù)處理
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 不同齡期棉鈴蟲ABCC1 在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量
        3.2.2 棉鈴蟲幼蟲不同組織中ABCC1 在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量
    3.3 討論
第四章 ABCC1 跨膜區(qū)原核表達(dá)及結(jié)合能力分析
    4.1 材料與方法
        4.1.1 供試?yán)ハx
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 儀器設(shè)備
        4.1.4 RNA的提取及cDNA的合成
        4.1.5 PCR擴(kuò)增兩個(gè)跨膜區(qū)(TMD1、TMD2)
        4.1.6 PCR產(chǎn)物的回收、轉(zhuǎn)化和測(cè)序鑒定
        4.1.7 雙酶切及重組表達(dá)載體構(gòu)建
        4.1.8 轉(zhuǎn)化及陽性克隆鑒定
        4.1.9 ABCC1 跨膜區(qū)片段的原核表達(dá)
        4.1.10 SDS-PAGE電泳及凝膠染色
        4.1.11 ABCC1 跨膜區(qū)片段的純化
        4.1.12 Ligand blot檢測(cè)
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 棉鈴蟲ABCC1 兩個(gè)跨膜區(qū)蛋白原核表達(dá)結(jié)果
        4.2.2 Ligand blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
    4.3 討論
第五章 棉鈴蟲ABCC1 基因的功能研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 供試?yán)ハx
        5.1.2 供試試劑與儀器設(shè)備
        5.1.3 合成siRNA及稀釋備用
        5.1.4 注射siRNA及基因干擾效率的檢測(cè)
        5.1.5 基因干擾后的生物測(cè)定
        5.1.6 Sf9 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
        5.1.7 Cry2Ab、Cry1Ac細(xì)胞生測(cè)蛋白制備
        5.1.8 pAc-ABCC1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.1.9 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞生測(cè)
    5.2 結(jié)果與分析
        5.2.1 qPCR檢測(cè)注射后的干擾效率
        5.2.2 ABCC1 基因沉默后對(duì)棉鈴蟲Cry2Ab、Cry1Ac蛋白敏感性的變化
        5.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ABCC1 基因的PCR檢測(cè)
        5.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后對(duì)Cry2Ab蛋白敏感性的變化
    5.3 討論
第六章 Cry1Ac抗性棉鈴蟲與敏感棉鈴蟲ABCC1 基因的比較
    6.1 材料與方法
        6.1.1 供試?yán)ハx
        6.1.2 供試試劑與儀器設(shè)備
        6.1.3 氨基酸序列對(duì)比分析
        6.1.4 在棉鈴蟲抗感品系中ABCC1 表達(dá)量差異分析
    6.2 結(jié)果與分析
        6.2.1 ABCC1 基因在抗性及敏感棉鈴蟲品系中編碼區(qū)氨基酸序列比對(duì)
        6.2.2 在棉鈴蟲抗感品系中ABCC1 表達(dá)量差異分析結(jié)果
    6.3 討論
第七章 全文總結(jié)
    7.1 主要結(jié)論
    7.2 創(chuàng)新點(diǎn)
    7.3 問題和展望
參考文獻(xiàn)
致謝
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本文編號(hào)：3855992