發(fā)布時(shí)間：2023-05-21 19:52

　　象耳豆根結(jié)線蟲(Meloidogyne enterolobii)在美洲、非洲、歐洲等均有分布,是世界上公認(rèn)的危害最大的根結(jié)線蟲之一。近年來(lái)我國(guó)熱帶、亞熱帶地區(qū)相繼報(bào)道象耳豆根結(jié)線蟲危害日趨嚴(yán)重,甚至有取代南方根結(jié)線蟲(Mincognita),而成為我國(guó)熱帶亞熱帶地區(qū)最重要根結(jié)線蟲種類的趨勢(shì)。然而,相比其他線蟲如模式線蟲秀麗小桿線蟲(Caenorhabdits elegans)、北方根結(jié)線蟲(M.hapla)和南方根結(jié)線蟲(Mincognita),至目前對(duì)象耳豆根結(jié)線蟲功能基因組的研究較少,關(guān)于其功能基因的分子生物學(xué)基礎(chǔ)的報(bào)道更是罕見(jiàn)。本研究以M enterolobii為對(duì)象,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期已獲得的cDNA文庫(kù)序列信息,結(jié)合RACE技術(shù),克隆到了促分裂原活化蛋白激酶基因(Me-mapk-1)和纖維素結(jié)合蛋白基因(Me-cbp-1)cDNA的全長(zhǎng)序列,并分別對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以及RNAi效應(yīng)分析。Me-mapk-1 cDNA全長(zhǎng)序列為1369 bp,包含長(zhǎng)度為27 bp的5’非編碼區(qū)、157 bp的3’非編碼區(qū)(包括24個(gè)堿基polyA尾巴)和一個(gè)1185 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF...

【文章頁(yè)數(shù)】：55 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 根結(jié)線蟲簡(jiǎn)介
        1.1.1 根結(jié)線蟲致病機(jī)理
        1.1.2 根結(jié)線蟲防治研究
    1.2 象耳豆根結(jié)線蟲研究進(jìn)展
        1.2.1 象耳豆根結(jié)線蟲的發(fā)生與分布
        1.2.2 象耳豆根結(jié)線蟲的生活史
        1.2.3 象耳豆根結(jié)線蟲分類地位及形態(tài)特征
    1.3 植物寄生線蟲促分裂原活化蛋白激酶研究進(jìn)展
        1.3.1 促分裂原活化蛋白激酶基因簡(jiǎn)介
        1.3.2 植物寄生線蟲促分裂原活化蛋白激酶基因的結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特點(diǎn)
        1.3.3 MAPK通路研究展望
    1.4 植物寄生線蟲纖維素結(jié)合蛋白研究進(jìn)展
        1.4.1 纖維素結(jié)合蛋白基因簡(jiǎn)介
        1.4.2 植物寄生線蟲纖維素結(jié)合蛋白基因的結(jié)構(gòu)及編碼蛋白特點(diǎn)
        1.4.3 植物寄生線蟲纖維素結(jié)合蛋白基因表達(dá)分析
    1.5 植物寄生線蟲RNAi研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的和意義
    1.7 研究的技術(shù)路線
2 材料和方法
    2.1 供試線蟲
    2.2 主要耗材與儀器
    2.3 主要配制試劑
    2.4 Me-mapk-1 cDNA第一鏈合成
        2.4.1 象耳豆根結(jié)線蟲J2總RNA提取
        2.4.2 cDNA第一鏈合成
    2.5 RACE獲Me-mapk-1的全長(zhǎng)
        2.5.1 mapk引物設(shè)計(jì)與合成
        2.5.2 RACE模板的獲得
        2.5.3 MAPK基因cDNA 3'末端擴(kuò)增
        2.5.4 產(chǎn)物的回收
        2.5.5 連接至T載體及轉(zhuǎn)化
        2.5.6 MAPK基因cDNA 5'末端擴(kuò)增
        2.5.7 MAPK全長(zhǎng)序列的克隆
    2.6 象耳豆根結(jié)線蟲MAPK基因的原核表達(dá)
        2.6.1 目的基因片段擴(kuò)增
        2.6.2 提取和鑒定質(zhì)粒DNA
        2.6.3 表達(dá)重組子pET-32a-mapk的建立
        2.6.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及篩選陽(yáng)性克隆
        2.6.5 提取pET-32a-MAPK質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21
        2.6.6 Me-MAPK的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.6.7 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)
    2.7 象耳豆根結(jié)線蟲MAPK基因的RNAi分析
        2.7.1 引物設(shè)計(jì)
        2.7.2 線蟲總RNA提取和cDNA獲得
        2.7.3 Me-mapk-1特異靶標(biāo)序列的獲得
        2.7.4 dsRNA的合成
        2.7.5 Me-mapk-1的RNAi分析
        2.7.6 侵染力分析
    2.8 RACE獲Me-cbp-1基因的全長(zhǎng)的克隆
        2.8.1 引物設(shè)計(jì)
        2.8.2 Me-cbp-1基因3'和5末端的擴(kuò)增
        2.8.3 Me-cbp-1 cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增
    2.9 Me-CBP-1的原位雜交
        2.9.1 標(biāo)記探針
        2.9.2 雜交前處理
        2.9.3 預(yù)雜交和雜交
        2.9.4 顯色觀察
    2.10 象耳豆根結(jié)線蟲cbp基因的RNAi分析
        2.10.1 引物設(shè)計(jì)
        2.10.2 線蟲總RNA提取和cDNA的獲得
        2.10.3 Me-cbp-1特異靶標(biāo)序列獲得
        2.10.4 dsRNA的合成
        2.10.5 Me-cbp-1的RNAi分析
        2.10.6 侵染力分析
3 結(jié)果與分析
    3.1 總RNA提取
    3.2 Me-mapk-1基因3'和5'末端的克隆
    3.3 ME-MAPK-1蛋白序列特征及結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測(cè)
    3.4 ME-MAPK1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
    3.5 Me-mapk-1 RNAi效應(yīng)分析
    3.6 Me-mapk-1 RNAi效應(yīng)表型分析
    3.7 Me-cbp-1 cDNA序列
    3.8 Me-CBP-1蛋白序列特征與結(jié)構(gòu)功能預(yù)測(cè)
    3.9 Me-cbp-1組織表達(dá)定位
    3.10 Me-cbp-1 dsRNA沉默
    3.11 Me-cbp-1 RNAi效應(yīng)分析
4 討論
    4.1 M. enterolobii的mapk基因
    4.2 M. enterolobii的cbp基因
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略表
附錄
致謝



本文編號(hào)：3821346