植物病害是人類面對的一個嚴(yán)峻的挑戰(zhàn),嚴(yán)重影響糧食產(chǎn)量以及人類的健康。利用植物自身的抗性基因抵抗病原菌的入侵,不僅可以保護(hù)植物自身,更可以減少農(nóng)藥的使用從而有利于保護(hù)環(huán)境。幾丁質(zhì)作為真菌細(xì)胞壁的主要成分之一,是一種典型的微生物相關(guān)的分子模式。在擬南芥中,幾丁質(zhì)被位于細(xì)胞膜上的兩個Lys M受體—CERK1和LYK5識別,從而激發(fā)植物的免疫反應(yīng)。前期的研究表明LYK5的功能主要是識別幾丁質(zhì),CERK1主要通過胞內(nèi)激酶傳遞免疫信號。LYK5的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域是一個假激酶,但在幾丁質(zhì)引起的免疫信號傳遞中不可缺少。為了研究LYK5胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域在幾丁質(zhì)引起的免疫信號通路中的功能,我們開展了如下研究:1. 在擬南芥中過表達(dá)LYK5-Myc融合蛋白,并篩選穩(wěn)定表達(dá)的LYK5-Myc轉(zhuǎn)基因株系。使用幾丁質(zhì)處理前處前和處理后的LYK5-Myc轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行蛋白親和純化,純化出的LYK5受體復(fù)合體應(yīng)用于蛋白組分析,鑒定到48個可能與LYK5互作的蛋白;2. 鈣離子依賴的蛋白激酶CPK5和CPK6是LYK5蛋白復(fù)合物中兩個組分。我們使用雙分子熒光互補(bǔ)試驗(Bi FC)驗證了CPK5和CPK6與LYK5互作,使用...

【文章頁數(shù)】：96 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
abstract
縮略表
第一章 植物免疫系統(tǒng)的研究綜述
    1.植物PTI免疫系統(tǒng)
        1.1 模式識別受體
            1.1.1 PRRs及對應(yīng)PAMPs
            1.1.2 PRRs受體復(fù)合體及下游信號組分
        1.2 植物PTI其他免疫反應(yīng)
            1.2.1 MAPK級聯(lián)反應(yīng)
            1.2.2 ROS,Ca²⁺爆發(fā)
        1.3 植物PTI反應(yīng)調(diào)控
            1.3.1 磷酸化和去磷酸化在PTI中的功能
            1.3.2 泛素化修飾在PTI信號通路中的影響
    2.植物的ETI調(diào)控系統(tǒng)
        2.1 效應(yīng)蛋白對植物PTI的影響
            2.1.1 效應(yīng)蛋白對PRRs的抑制作用
            2.1.2 效應(yīng)蛋白對MAPK級聯(lián)反應(yīng)的影響
        2.2 植物體內(nèi)的R基因及對應(yīng)的效應(yīng)蛋白識別
    3.鈣調(diào)蛋白的功能研究
        3.1 植物中受鈣離子調(diào)節(jié)的蛋白激酶
        3.2 CDPKs在植物中的功能研究
    4.研究目的和意義
第二章 材料和方法
    1.1 質(zhì)粒載體和菌株
    1.2 擬南芥的種植和生長管理
        1.2.1 材料
        1.2.2 方法
    1.3 擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
        1.3.1 材料和試劑
        1.3.2 載體構(gòu)建
        1.3.3 擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化
    1.4 親和純化LYK5-Myc受體復(fù)合體蛋白
        1.4.1 試劑和材料
        1.4.2 實驗方法
    1.5 雙分子熒光互補(bǔ)實驗
        1.5.1 載體構(gòu)建
        1.5.2 在煙草葉片中瞬時表達(dá)分析
    1.6 蛋白免疫印跡實驗
        1.6.1 SDS-PAGE凝膠制備
        1.6.2 轉(zhuǎn)膜
        1.6.3 孵育抗體和曝光
    1.7 免疫共沉淀實驗
        1.7.1 試劑與材料
        1.7.2 方法與步驟
    1.8 體外蛋白純化實驗
        1.8.1 載體構(gòu)建
        1.8.2 轉(zhuǎn)化E.coli BL21 Condon Plus(DE3)菌株
        1.8.3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)檢測
        1.8.4 體外親和純化標(biāo)簽蛋白質(zhì)
    1.9 體外磷酸化實驗
        1.9.1 試劑和材料
        1.9.2 步驟
    1.10 熒光定量分析基因相對表達(dá)
        1.10.1 RNA提取
        1.10.2 RNA反轉(zhuǎn)錄c DNA
        1.10.3 q RT-PCR反應(yīng)
        1.10.4 q RT-PCR數(shù)據(jù)分析
    1.11 活性氧測定
        1.11.1 試劑及材料
        1.11.2 步驟
    1.12 胼胝體沉淀染色
        1.12.1 試劑和材料
        1.12.2 實驗步驟
第三章 結(jié)果與分析
    1.鑒定與LYK5互作的蛋白
    2.CPK5缺失突變影響幾丁質(zhì)引起的免疫反應(yīng)
    3.幾丁質(zhì)受體LYK5和LYK4 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域受CPK5和CPK6 磷酸化調(diào)控
    4.CPK5 磷酸化LYK5 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域位點(diǎn)的鑒定
    5.LYK5磷酸化位點(diǎn)突變體表型鑒定
    6.CPK5 穩(wěn)定CERK1 蛋白水平的研究
第四章 討論
參考文獻(xiàn)
附錄一 本課題所用引物序列
附錄二
附錄三 在讀期間發(fā)表論文
致謝



本文編號：3812094