PevD1是作者實驗室從大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)XII8菌株發(fā)酵液中分離獲得的蛋白激發(fā)子。Nbnrp1是前期篩選出的PevD1在本生煙中的互作蛋白,利用RNAi技術(shù)獲得了Nbnrp1-RNAi轉(zhuǎn)基因本生煙植株,初步證明Nbnrp1能調(diào)控PevD1誘導(dǎo)的細胞壞死和抗病性。本文在前期的基礎(chǔ)上,進一步明確了Nbnrp1在PevD1誘導(dǎo)本生煙產(chǎn)生抗病性中的作用,并通過轉(zhuǎn)錄組測序的方法,對本生煙野生型(WT)和Nbnrp1沉默株系(Nbnrp1-RNAi)在PevD1誘導(dǎo)前后的差異表達基因進行篩選及功能分析,闡述了Nbnrp1調(diào)控PevD1誘導(dǎo)本生煙抗病性的分子機制,主要研究結(jié)果如下:1.建立了PevD1的真核表達體系,獲得了純化的真核表達蛋白構(gòu)建了PevD1的真核表達載體pPICZαA-PevD1,并通過電轉(zhuǎn)的方法將表達載體轉(zhuǎn)入畢赤酵母感受態(tài)中;經(jīng)博萊霉素Zeocin抗性篩選,獲得陽性轉(zhuǎn)化子并進行PevD1蛋白的誘導(dǎo)表達和純化;通過SDS-PAGE和Western blot技術(shù)驗證了融合蛋白的正確性;純化的PevD1蛋白能夠誘導(dǎo)本生煙葉片產(chǎn)生細胞壞死(HR反應(yīng)),...

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 引言
    1.1 激發(fā)子的研究現(xiàn)狀
    1.2 植物誘導(dǎo)抗病性的機制研究
    1.3 萜類次生代謝產(chǎn)物與植物抗性
    1.4 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)及應(yīng)用
        1.4.1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物抗病機制研究中的應(yīng)用
    1.5 蛋白激發(fā)子PEVD1 的研究背景
        1.5.1 激發(fā)子PevD1 的分離及功能研究
        1.5.2 PevD1 誘導(dǎo)植物抗病的機制研究
    1.6 NRP蛋白的研究背景
    1.7 本研究的目的及意義
    1.8 本研究技術(shù)路線
第二章 PEVD1 的真核表達與純化
    2.1 實驗材料
        2.1.1 質(zhì)粒和菌株
        2.1.2 試劑和儀器
        2.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 PevD1 真核表達載體的構(gòu)建
        2.2.2 酵母感受態(tài)的制備、轉(zhuǎn)化
        2.2.3 PevD1 的真核表達
        2.2.4 PevD1 的純化
        2.2.5 PevD1 蛋白濃度的測定
        2.2.6 PevD1的Western-blot鑒定
        2.2.7 真核表達的PevD1 誘導(dǎo)本生煙HR的活性檢測
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 PevD1 真核表達載體的構(gòu)建
        2.3.2 PevD1 的表達、純化、鑒定及活性檢測
    2.4 本章小結(jié)
第三章 NBNRP1 正調(diào)控PEVD1 誘導(dǎo)本生煙產(chǎn)生的防御反應(yīng)和系統(tǒng)抗性
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株和植物材料
        3.1.2 實驗試劑和儀器
        3.1.3 培養(yǎng)基與試劑配制
    3.2 實驗方法
        3.2.1 植物培養(yǎng)
        3.2.2 DAB組織染色法檢測過氧化氫的沉積
        3.2.3 PevD1 誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的產(chǎn)生
        3.2.4 PevD1 誘導(dǎo)MAPK級聯(lián)反應(yīng)的激活
        3.2.5 PevD1 誘導(dǎo)本生煙對 TMV 的抗性實驗
        3.2.6 PevD1 誘導(dǎo)本生煙對大麗輪枝菌的抗性實驗
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 過氧化氫沉積的檢測
        3.3.2 胼胝質(zhì)沉淀的觀察
        3.3.3 MAPK 級聯(lián)反應(yīng)激活檢測
        3.3.4 PevD1誘導(dǎo)本生煙對TMV的抗性實驗
        3.3.5 PevD1誘導(dǎo)本生煙對大麗輪枝菌的抗性實驗
    3.4 本章小結(jié)
第四章 轉(zhuǎn)錄組測序
    4.1 實驗材料
        4.1.1 激發(fā)子與植物材料
        4.1.2 實驗試劑和儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 植株的準備
        4.2.2 PevD1 處理本生煙
        4.2.3 取樣、RNA的提取及質(zhì)量檢測
        4.2.4 文庫構(gòu)建及測序
        4.2.5 測序數(shù)據(jù)的過濾及參考基因組的比對
        4.2.6 基因表達定量
        4.2.7 差異表達基因的篩選
        4.2.8 差異表達基因的GO分析
        4.2.9 差異表達基因的Pathway分析
    4.3 結(jié)果及分析
        4.3.1 RNA的質(zhì)量檢測
        4.3.2 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控和參考基因組的比對
        4.3.3 樣品的相關(guān)性分析
        4.3.4 差異表達基因(DEGs)的篩選及功能分析
    4.4 本章小結(jié)
第五章 轉(zhuǎn)錄組差異表達基因的定量驗證
    5.1 實驗材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 實驗試劑和儀器
    5.2 實驗方法
        5.2.1 qPCR引物設(shè)計
        5.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄
        5.2.3 qPCR反應(yīng)體系及程序
        5.2.4 qPCR結(jié)果統(tǒng)計與分析
    5.3 結(jié)果及分析
        5.3.1 轉(zhuǎn)錄組中抗病相關(guān)差異表達基因的驗證
        5.3.2 倍半萜類次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的qPCR驗證
    5.4 本章小結(jié)
第六章 全文結(jié)論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡歷



本文編號：3809525